间充质干细胞源性外泌体治疗脊髓损伤的研究进展*

张鑫瑞,韩 悦 综述,耿承奎 审校

(昆明医科大学附属延安医院骨科,云南 昆明 650051)

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是中枢神经系统的一种严重创伤性疾病,导致脊髓功能的损伤[1],患者表现为损伤平面以下运动和感觉的严重障碍。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种来源于体内多种组织,具有自我更新和多向分化的潜能的细胞[2]。外泌体(exosomes,Exos)源于MSCs,是一种细胞分泌物,较MSCs具有一定的优势[3]。SCI主要分为原发性损伤和继发性损伤两个病理过程,原发性损伤是指脊髓受到外力后发生的损伤,原发性损伤后会引起继发性损伤[4]。针对SCI的治疗,目前集中治疗继发性损伤,为了减轻SCI患者的功能障碍,探索新的SCI治疗方案是全球都密切关注的问题,目前Exos是对SCI治疗的研究热点,因此,本文将从MSCs来源Exos对促进SCI后神经元细胞的再生进行综述,现报告如下。

1 脊髓损伤后神经元细胞的凋亡

细胞凋亡是细胞的程序性死亡,神经元细胞凋亡的作用机制复杂。SCI后可造成损伤区域神经元的凋亡以及局部微环境的改变,微环境的改变对神经元的修复和再生产生抑制作用,并且经过一系列复杂的反应加速了神经元的凋亡[5],脊髓神经细胞的凋亡对SCI的功能和预后起重要作用。有研究报道[6],凋亡启动子(Caspase-1、2、4、5、8、9、10)和凋亡执行子(Caspase-3、6、7、14)在神经元细胞凋亡中都起到重要作用,可以通过作用于细胞凋亡信号通路的下游阶段,激活神经元细胞的凋亡过程,导致发生凋亡,其中Caspase-3是最重要的分子。虽然通过研究已知一些和神经元细胞凋亡有关的促进因子,但是凋亡仍是一个复杂的病理生理过程,具体机制还需要进一步的研究。现在,已被报道的神经元细胞凋亡途径有氧化应激反应、线粒体途径和死亡受体途径,可以为SCI后修复提供新思路。

1.1 氧化应激反应

氧化应激反应是脊髓损伤后氧化和抗氧化作用失衡的一种关系,氧化大于抗氧化作用,以大量自由基生成为特征,产生负面作用,导致神经元细胞凋亡的发生[7]。在一般情况下,各组织细胞可产生抗氧化酶清除产生的自由基,避免自由基对所在的组织器官带来损害,但脊髓损伤后,自由基的生成量超出抗氧化酶的清除范围,导致自由基大量存在于SCI处,对神经元产生损害,最终对脊髓造成继发性损伤。抑制氧化应激反应可以对SCI后神经元起到保护的作用。

1.2 线粒体途径

线粒体是存在于大多数细胞中的半自主细胞器,能对细胞产生供能的作用,并参与细胞中的多种反应。脊髓损伤后,神经元细胞中产生的信号诱导线粒体中的细胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)释放到基质中,引起凋亡蛋白酶活化因子-1(Apoptotic Protease Activating Factor-1,APAF-1)激活半胱天冬酶-9(Caspase-9),导致凋亡蛋白酶即半胱天冬酶-3(Caspase-3)被激活,引起神经元细胞的凋亡。当线粒体通透性增加时,引起膜内Cyt-C的快速释放,加速了神经元细胞的凋亡进程[8]。

1.3 死亡信号途径

死亡信号途径在神经细胞凋亡中发挥着重要作用,死亡信号途径中重要的介导因子是调亡相关因子(Factor associated suicide,Fas),Fas是肿瘤坏死因子受体家族(Tumor Necrosis Factor Receptor,TNFR)中的一种蛋白,通过跨膜传递信号,其在I型受体细胞基质中的结构称为死亡结构域(Death Domain,DD),可传递神经元细胞凋亡的信号,Fas可与配体在DD结合,直接作用于Caspase家族中的一些分子,经过一系列反应激活Caspase-3,导致神经元细胞凋亡的发生。

2 间充质干细胞治疗脊髓损伤

MSCs来源于多能干细胞,是一类具有自我更新和多向分化潜能的基质细胞,因其增值能力强、来源广泛、易于分离和保存等特点,被广泛运用于各项基础研究和临床研究,MSCs通过多种机制修复SCI,对SCI后神经元细胞的再生和神经功能恢复具有促进作用。脊髓损伤后造成了损伤区域神经元细胞的丢失和凋亡,并产生对神经元细胞再生有抑制作用的微环境,MSCs移植可促进神经元细胞修复和再生,分化为具有特定功能的神经细胞替代损伤的神经细胞,还可通过旁分泌产生抗炎、抗氧化应激、抗凋亡、促进营养物质释放的作用[9],调节微环境,促进轴突生长。但有研究显示[10],MSCs移植具有存活率低、靶向性差、成瘤性和低神经元分化性,并且在脊髓损伤微环境中细胞存活时间短等,所以在临床应用MSCs具有不稳定性和不安全性等。

3 间充质干细胞来源的外泌体

Exos来源于胞内体,细胞膜内陷形成胞内体,早期形成的胞内体在活性物质的积累和其他蛋白质的参与下形成晚期胞内体,最终形成多囊泡体,多囊泡体与细胞膜融合后释放到细胞外,形成直径为40～100nm的细胞外小囊泡,内含核酸、蛋白质、脂质、细胞因子、转录因子受体和生物活性物质[11]。在使用MSCs的早期,Exos被当作细胞代谢的无关物质,一直都未对其进行深入研究,直到最近几年,外泌体的作用才逐渐被人们所关注。Exos经过细胞的旁分泌后与靶细胞的受体相结合,传递细胞间信号并将所携带的物质运输至靶细胞,从而调节细胞的功能。间充质干细胞来源的外泌体(MSCs-Exos)被用于多领域的研究并取得了一定的疗效,但在脊髓损伤中运用的研究还处于早期阶段。MSCs-Exos和MSCs有相似的功能,但MSCs-Exos较MSCs具有稳定性高、剂量和浓度易于控制、易于运输和贮存并且无免疫排斥反应等特点,使其在SCI的治疗中更具有优势。

4 MSCs-Exos治疗脊髓损伤

MSCs-Exos对SCI的治疗在近几年来受到人们的关注,脊髓损伤后导致脊髓周围的血管破裂、出血、神经元细胞的轴突断裂,造成瓦勒变性,进而加重轴突坏死、髓鞘分解,从而抑制轴突再生[12]。脊髓损伤后,在原发性损伤的基础上发生继发性损伤,加重了损伤的严重程度,对损伤的预后起着重要作用,研究发现[13],MSCs-Exos中的微小RNA(MicroRNA,miRNA)能改善继发性损伤,促进神经元细胞的修复和再生。

4.1 MSCs-Exo抑制脊髓损伤后的炎症反应

有研究发现[14]用骨髓干细胞来源的外泌体(BMSCs-Exos)对SCI大鼠和小胶质细胞进行处理,结果抑制了促炎因子水平,并提高了大鼠的运动功能,在大鼠的神经元细胞中发现miRNA-181c的水平升高并且核因子信号的磷酸化水平受到抑制,说明BMSCs-Exos可以抑制细胞的炎症反应,从而保护受损的神经元细胞。当中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)受损时,处于静息状态的星形胶质细胞就会向起到促进神经元细胞的凋亡、抑制轴突生长作用的A1型星形胶质细胞进行转化,有研究表明[15]在SCI后BMSCs-Exos抑制A1型星形胶质细胞的转化,从而减少了脊髓损伤部位的炎症反应,降低了TNF-α、C3等促炎因子的表达水平,说明BMSCs-Exos可通过抑制星形胶质细胞向A1型转化,从而起到保护神经元细胞的作用。

4.2 MSCs-Exo抑制脊髓损伤后的细胞凋亡

一般来说,神经细胞受损发生凋亡后是不能再生的,脊髓损伤后神经元出现一系列反应后导致细胞凋亡。miRNA是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子,能参与生物体内的病理生理过程,对细胞的生长发育起到重要作用,miRNA与SCI后神经元细胞凋亡、炎症、氧化应激等反应密切相关[16]。有研究证明了[17]将含有miRNA-544的MSCs-Exo注射到SCI大鼠模型中,并分析了其组织的促炎因子的水平,结果显示注射了含miRNA-544的MSCs-Exo大鼠神经元细胞的丢失和凋亡减少,并且促进了大鼠神经功能的恢复。

4.3 MSCs-Exo促进脊髓损伤后神经细胞轴突的生长

神经元细胞轴突的生长在脊髓损伤后神经修复和再生中起着重要作用,生长相关蛋白43(Growth-associated protein,GAP-43)和神经丝蛋白200(Neurofilament protein,NF-200)是轴突生长的重要蛋白。研究表明[18],BMSCs-Exos通过作用于STAT3/GAP-43通路,改善SCI后大鼠的感觉功能,结果显示注射了BMSCs-Exos的大鼠细胞中NF-200染色阳性的数量增加,转录激活因子3(Signal transducers and activators of transcription,STAT3)和生长相关蛋白43(GAP-43)的表达增加,说明BMSCs-Exos能通过作用于STAT3/GAP-43通路改善大鼠的感觉功能,促进轴突再生,进而促进神经元细胞的修复和再生。SCI后轴突的生长并不是只有一种形式,也不只受单个因素影响,因此,不同程度的脊髓损伤需要用不同的治疗方案来促进其轴突的再生。

5 讨论

脊髓损伤后会导致多系统的功能障碍,并且出现继发性损伤,严重影响患者的生活质量,为了攻克这一难题,研究人员对SCI患者提出了诸多治疗方案,但临床效果并不明显。近年来,间充质干细胞来源Exos治疗SCI逐渐被人们所重视,Exos与MSCs相比具有较高的存活率和低免疫原性等优势,被广泛运用于各个领域的研究。Exos对脊髓损伤后神经元细胞的修复和再生有良好的促进作用,对损伤局部微环境有改善效果,因此对SCI小鼠治疗效果明显,也可作为载体靶向治疗疾病。因Exos被关注的时间比较晚,大部分实验还处于基础研究阶段,其作用和功能需进一步探索,但其有望成为今后临床治疗脊髓损伤后神经恢复的有效治疗手段。