白头翁汤对DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织mTORC1-STAT3-COX-2信号通路的影响

何琼姿,韦鹏,刘欢欢,张俊芝,刘彤彤,石琨群,徐艺,刘史佳

(1.南京中医药大学附属医院/江苏省中医院,江苏 南京 210029;2.南京中医药大学第一临床医学院,江苏 南京 210023;3. 南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC)属于炎症性肠病(Inflammatory bowel disease, IBD)的范畴,是一种慢性特发性肠道疾病，其特征是从直肠近端延伸的持续性黏膜炎症[1]。目前对于UC的治疗药物主要为氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂、英夫利西单抗(IFX)等，这些药物能在一定程度上缓解结肠炎症,但仍然存在治疗局限性、疗效差、患者不耐受等情况[2]。中医药治疗UC由来已久,并且已经在临床上取得较好疗效,其中以白头翁汤为代表的仲景方最为多用。白头翁汤由白头翁、黄连、黄柏、秦皮组成,主治热毒痢疾,广泛应用于湿热型UC。现代研究表明白头翁汤可通过调节肠道菌群、改善短链脂肪酸代谢、维持Th17/Treg平衡、抑制IL-6/STAT3信号通路等方式改善结肠炎症[3-5]。

mTORC1是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)中的一种复合物。越来越多的证据表明,mTORC1与结肠炎症的发生发展有着密切联系。结肠上皮mTORC1-STAT3-COX信号轴能介导辅助性T细胞17(Th17)炎性浸润，从而促进UC的发生[6]。然而mTORC1相关的信号通路在白头翁汤缓解UC的作用机制中还未被报道。本课题拟采用3.5%葡聚糖硫酸钠(DSS)构建小鼠UC模型,造模同时每日给予小鼠白头翁汤干预,并以mTORC1抑制剂雷帕霉素给药组小鼠作为阳性对照,通过检测白头翁汤给药对mTORC1-STAT3-COX-2信号通路的影响,探讨其预防UC的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6雌鼠购自南京大学模式动物研究所,动物许可证号:SYXK(苏)2018-0008，饲养于江苏省中医院药理实验室SPF动物房。饲养条件:12 h亮/暗循环,相对湿度50%～60%,室内温度25 ℃。适应性饲养1周左右,待体质量达20 g左右进行造模。本研究经南京中医药大学附属医院实验动物伦理委员会批准，伦理批号：2022DW-16-02。

1.2 实验药物

白头翁汤中药饮片由白头翁15 g，黄柏6 g，黄连12 g，秦皮12 g组成,购自南京中医药大学附属医院。按照5∶2∶4∶4的比例称取白头翁、黄柏、黄连、秦皮药材饮片,加10倍水煎2次,每次30 min。合并2次药液,滤去残渣,按给药剂量浓缩到所需浓度,储存于4 ℃;羧甲基纤维素钠(CMC-Na,上海源叶生物科技有限公司,批号:20210107);雷帕霉素(Rapamycin,上海源叶生物科技有限公司,批号:H03A10Y94335),给药剂量为2 mg·kg-1;DSS(美国MP Biomedicals公司,批号:S6132),用纯水溶解,造模浓度为3.5%。

1.3 试剂与仪器

核糖体S6蛋白激酶(P70S6K)抗体、磷酸化核糖体S6蛋白激酶(p-P70S6K)抗体、信号转导及转录激活因子3(STAT3)抗体、磷酸化信号转导及转录激活因子3(p-STAT3)抗体(美国Cell Signaling Technology公司,批号:9202、9234、4904、9134);哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗体、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)抗体、内参Tubulin抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,批号:66878-1-Ig、67778-1-Ig,11224-1-AP); LEGENDplex多因子检测试剂盒(美国BioLegend公司,批号:B328132);总RNA提取试剂盒(上海翌圣生物科技有限公司,批号:M2114061);逆转录试剂盒(南京诺唯赞医疗科技有限公司,批号:7E581J1);BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海翌圣生物科技有限公司,批号:B6102060);RIPA裂解液(北京索莱宝生物科技有限公司,批号:20211123);蛋白酶抑制剂Cocktail(Biosharp生物科技公司,批号:21340508);磷酸酶抑制剂(Biosharp生物科技公司,批号:21291683);高速离心机(美国赛默飞世尔科技公司,型号:Legend Micro 21R);酶标仪(杭州奥盛仪器有限公司,型号:AMR-100);荧光分子成像系统(上海弘基电脑有限公司,型号:C500×);电泳仪(美国Bio-Rad公司,型号:Mini-PROTEAN Tetra);荧光定量PCR仪(美国赛默飞世尔科技公司,型号:QuantStudio3);流式细胞仪(美国贝克曼库尔特公司,型号:Navios)。

1.4 实验分组及给药

40只成年雌性C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、白头翁汤组及雷帕霉素组,每组10只。空白组小鼠正常饮水,其他3组小鼠每日给予3.5%的DSS溶液诱发炎症。从造模第1天开始同时伴随给药处理。白头翁汤组每日予以0.2 mL药液进行灌胃,雷帕霉素组小鼠每日腹腔注射0.2 mL雷帕霉素药液,空白组和模型组则对应用等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃。每日在固定时间段记录各组小鼠体质量及粪便性状,并进行DAI评分。7 d后处死小鼠进行取材,眼眶取血,摘取结肠并测量盲肠中部到结肠末端的长度,取1 cm干净组织放入4%多聚甲醛固定液,剩余结肠组织保存在-80 ℃。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 DAI评分 DAI评分由体质量下降分数、粪便性状分数与便血分数组成。质量每下降5%为1分,以此类推,最高4分;粪便形态从正常到水样不成型分别记0～4分;便血程度从无血便到肉眼可见明显血便分别记0～4分。三者相加,即为DAI评分。

1.5.2 组织病理学分析 将固定在多聚甲醛中的结肠组织依次进行石蜡包埋、切片、HE染色及封片,最后用显微镜镜检,并分析采集图片。病理评分标准分为上皮损伤及黏膜炎细胞浸润2个方面。按照损伤或浸润程度分别计0～4分,两者相加即为组织病理学评分。

1.5.3 高通量流式技术检测炎症因子 小鼠眼眶取血后,3 000 r·min-1离心15 min,吸取上清液置于干净的无酶EP管。血清样本处理步骤按照LEGENDplex多因子试剂盒说明书执行,使用贝克曼流式细胞仪进行检测。

1.5.4 Western blot检测结肠组织p-P70S6K、p-STAT3、p-mTOR蛋白表达水平 称取20 mg小鼠结肠组织,加入200 μL RIPA-PMSF-磷酸酶抑制剂混合液,匀浆后置于冰上裂解30 min,充分裂解后12 000 r·min-1离心10 min,吸取上清,按照BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量。蛋白样品存于-20 ℃。每次使用20 μg总蛋白质样品进行10%的SDS-PAGE电泳,电泳电压恒定200 V。将凝胶转移到NC膜上在300 mA下转膜1.5 h。转膜结束后,用5%脱脂牛奶将NC膜封闭0.5 h。封闭结束后清洗条带,按说明书稀释抗体,4 ℃孵育摇床过夜。回收一抗,清洗条带,按1∶10 000的比例配制二抗,室温条件孵育1 h。倒掉二抗,条带用PBST清洗3次。按1∶1比例配制发光显影液,进行曝光。保存图片并用ImageJ对图像灰度进行定量分析。

1.5.5 免疫组化检测结肠组织p-P70S6K的阳性表达 将存于固定液中的结肠组织进行蜡块包埋后,依次进行石蜡切片、脱蜡脱水、柠檬酸抗原修复、PBS洗涤、3%双氧水缓冲液阻断内源性过氧化物酶、3%BSA封闭、加一抗孵育过夜、加二抗孵育60 min、DAB显色、苏木素复染、干燥脱水、封片处理。最后镜检,并将白光显微镜下的图像阳性面积所占比例进行评分,评分越高,表明阳性比例越大。

1.5.6 qPCR检测结肠组织中COX-2 mRNA表达 剪取12 mg左右小鼠结肠组织,按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,采用超微量荧光紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度。依照试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA,将合成的cDNA 作为荧光定量的模板,对内参β-actin及COX-2的基因进行扩增。扩增引物由擎科生物科技有限公司合成。引物序列:β-actin上游5'-CTGTGCCCATCTACGAGGGCTAT-3',β-actin下游5'-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3';COX-2上游5'-GCGACATACTCAAGCAGGAGCA-3',COX-2下游5'-AGTGGTAACCGCTCAGGTGTTG-3'。实验结果利用2-ΔΔCt公式进行计算。

2 结果

2.1 白头翁汤对UC小鼠一般情况的影响

白头翁汤对DSS诱导的小鼠UC的影响通过DAI评分、体质量下降百分比、结肠长度来评估。图1A是小鼠的体质量下降百分率图,由图可知空白组小鼠呈自然增长,曲线平缓,模型组小鼠随着时间增长,炎症逐步加重从而导致体质量持续下降,而白头翁汤组与雷帕霉素组曲线介于模型组与空白组之间,且数值与模型组均有显著性差异(P<0.001)。图1B是小鼠第7天的DAI评分图,由体质量减失率分数、粪便性状分数和便血分数相加而得,能综合地评估小鼠的炎症程度。空白组小鼠DAI评分最低,模型组最高,雷帕霉素组与白头翁汤组DAI评分与模型组相比显著下调(P<0.001)。图1C分别为小鼠结肠长度定量统计,可以看到空白组小鼠结肠长度最长,模型组结肠长度最短,而雷帕霉素组与白头翁汤组则明显改善了这种缩短趋势(P<0.01,P<0.001)。

注:Control.空白组;DSS.模型组;BTW.白头翁汤组;RAPA.雷帕霉素组;与空白组比较,###P<0.001;与模型组比较,***P<0.001,**P<0.01。图1 白头翁汤改善了DSS诱导的结肠炎症状Fig.1 Baitouweng decoction ameliorated the symptoms of DSS-induced colitis

2.2 UC小鼠的组织病理学分析

小鼠结肠组织HE染色结果如图2所示,空白组小鼠黏膜层上皮完整,细胞排列紧密,形态正常,排列紧密,杯状细胞丰富,无炎性浸润。模型组组织广泛溃疡,黏膜上皮及肠腺丢失,伴大量杯状细胞丢失,有较多炎性细胞浸润,黏膜下层出现水肿。白头翁汤和雷帕霉素给药组小鼠结肠组织炎性细胞浸润更少,组织损伤程度减轻。病理学评分如表1所示,空白组最低,模型组最高。与模型组相比,白头翁汤组和雷帕霉素组评分均下降(P<0.01，P<0.001)。

图2 各组小鼠结肠组织的代表性HE染色图(×200)Fig.2 Representative hematoxylin-eosin (HE) staining of colon tissues of mice in each group (×200)

表1 各组小鼠结肠组织病理学评分Table 1 Histological scores of colon tissues of mice

2.3 白头翁汤对UC小鼠炎症因子表达的影响

与空白组相比,模型组小鼠血清中炎症因子IL-6、TNF-α含量明显升高(P<0.001)。与模型组相比,在给予白头翁汤与雷帕霉素干预的小鼠中,IL-6含量下降(P<0.001),TNF-α也发生下调(P<0.001，P<0.01)。见表2。

表2 各组小鼠血清IL-6和TNF-α的含量Table 2 Contents of IL-6 and TNF-α in mouse

2.4 小鼠结肠组织中p-mTOR、p-STAT3、p-P70S6K蛋白表达情况

如图3,各组小鼠结肠组织中mTOR、STAT3和P70S6K总蛋白表达情况接近。空白组p-mTOR、p-STAT3和p-P70S6K表达最少,而模型组小鼠结肠中这三种磷酸化蛋白表达最高。与模型组相比,白头翁汤组和雷帕霉素组小鼠结肠组织p-mTOR、p-STAT3和p-P70S6K蛋白表达减少。目的蛋白定量结果如表3,与模型组相比,白头翁汤组和雷帕霉素组p-mTOR/mTOR、p-STAT/STAT3和p-P70S6K/P70S6K值均下降(P<0.05，P<0.01,P<0.001)。

图3 小鼠结肠组织免疫印迹电泳图Fig.3 Western blot images of mouse colon tissues

表3 各组小鼠结肠组织p-P70S6K/P70S6K、p-STAT/STAT3和p-mTOR/mTOR值比较Table 3 Comparison of p-P70S6K/P70S6K、p-STAT/STAT3 and p-mTOR/mTOR in colon tissue of mice in each

2.5 免疫组化检测小鼠结肠组织p-P70S6K蛋白表达

如图4与表4所示,p-P70S6K在空白组少量肠黏膜上皮细胞胞浆中呈阳性表达,在模型组肠黏膜上皮及炎细胞中表达明显增加。与模型组相比,白头翁汤组和雷帕霉素组小鼠结肠组织中p-P70S6K表达明显下降,组化评分也显著降低(P<0.001)。

2.6 小鼠结肠组织COX-2 mRNA表达情况

与空白组相比,模型组小鼠结肠组织中COX-2 mRNA表达水平明显升高(P<0.001)。与模型组相比,白头翁汤及雷帕霉素给药组小鼠结肠组织中COX-2 mRNA表达水平均降低(P<0.001)。见表5。

图4 各组小鼠结肠组织p-P70S6K免疫组化图片(×200)Fig.4 The immunohistochemical staining of p-P70S6K in mouse colon tissues (×200)

表4 各组小鼠结肠组织p-P70S6K免疫组化评分Table 4 The immunohistochemical score of p-P70S6K in

表5 各组小鼠结肠组织COX-2 mRNA表达情况Table 5 The mRNA level of COX-2 in mouse colon

3 讨论

UC作为一种反复发作且难以治愈的慢性肠道疾病,通常认为其发病机制与肠道微生物的改变、宿主免疫系统破坏、遗传易感性等因素有关[7]。UC的主要临床表现为腹痛、腹泻、黏浓液、便血,可恶化为结肠癌。近年来,UC的发病率在世界各地都在持续升高[8],已经成为了一种全球性疾病。我国在2012 IBD共识中提到中医药可用于防治UC。UC属中医“下利” “久痢”“肠癖”“痢疾”等范畴。中医认为,湿热内蕴贯穿UC发生发展的始终,素体脾气虚弱是发病基础,情志失调是发病诱因[9]。白头翁汤作为仲景方中的清利名方之一,其对UC的治疗效果早有记载。《金匮要略》中提到“下利欲饮水者,以有热故也,白头翁汤主之”。白头翁汤由白头翁、黄连、黄柏、秦皮组成,全方四味药均为清热解毒止痢要药,四药合用,为治疗热毒血痢之良方。

mTOR是一个对结肠炎症的发生发展有着重要意义的信号通路。多种炎症因子如 TNF-α、IL-10、IL-6 及 IL1-β等分泌均受 mTOR 信号调节。抑制mTOR能显著减少了肠黏膜中的白细胞黏附和外渗、降低T细胞数量并阻断淋巴细胞的干扰素释放，从而改善结肠炎症[10-11]。mTORC1是mTOR其中的一种复合物,它通过感应来自细胞内外的各种信号来促进物质代谢、参与细胞凋亡与自噬、调控细胞生长增殖等多种生理过程[12]。近来研究表明,mTORC1在UC患者及小鼠的结肠组织中表达升高,导致炎症症状加剧[6]。这表明,mTORC1可能对UC的发展有潜在的意义。STAT3是信号转导及转录激活因子(STAT)家族中的一员,它在诱导和维持炎症环境及肿瘤形成中发挥着重要作用。STAT3的异常活化是多种疾病发生的诱因[13]。IL-6等细胞因子可通过与其表面抗体结合直接激活STAT3从而促进炎症[14]。COX-2 是环氧化酶(COX)的异构体,它与炎症反应、肿瘤的发生发展密切相关[15]。在动物模型中,抑制COX-2表达能明显改善DSS诱导的UC小鼠体质量减轻、腹泻和便血症状[16]。COX-2通过产生对炎症、疼痛有促进作用的前列腺素(PGs)从而诱导UC[17]。其中最主要的PGs为前列腺素E2(PGE2),高水平的PGE2通过激活树突细胞(DCs)过表达白细胞介素23(IL-23)使结肠炎症恶化,并且促进Th17细胞分化从而进一步加剧炎症反应[18]。在mTORC1-STAT3-COX-2信号轴中,mTORC1在Ser727位点磷酸化STAT3[19],活化的STAT3激活COX-2转录[20],从而促进IL-6等炎症因子的释放以及Th17浸润从而导致结肠炎症[21-22]。

在本次实验中,白头翁汤方剂和mTORC1抑制剂雷帕霉素均体现出了对DSS诱导的小鼠结肠炎症的预防作用。相较于模型组,白头翁汤和雷帕霉素组小鼠体质量下降幅度更小,DAI评分更低,结肠长度更长,组织病理学评分更低,炎症因子IL-6、TNF-α表达更少。P70S6K是mTORC1下游标志性底物之一,其磷酸化程度可作为检测mTORC1活性的重要指标。与模型组相比,白头翁汤组和雷帕霉素组小鼠结肠组织中p-P70S6K/P70S6K值下降,证明了白头翁汤和雷帕霉素对mTORC1的抑制作用。同时,在2组小鼠结肠组织中,p-STAT3/STAT3值和COX-2 mRNA的表达水平也发生了下降。综上,本次研究证明了mTORC1可作为UC治疗的靶标,白头翁汤能有效预防DSS诱导的小鼠结肠炎症,其作用通过抑制mTORC1-STAT3-COX-2信号通路来实现。