饲料中添加蚕豆对罗非鱼生长性能、肠道消化酶活性、肠道形态和肠道菌群的影响

2023-02-08赵红霞王国霞曹俊明卢迈新曹建萌

动物营养学报 2023年1期

符兵彭凯陈冰* 彭振赵红霞王国霞黄文,4 曹俊明卢迈新曹建萌蔡佳

(1.广东海洋大学，湛江 524088；2.广东省农业科学院动物科学研究所，农业农村部华南动物营养与饲料重点试验室，广东省畜禽育种与营养研究重点试验室，广州 510640；3.茂名市农业科技推广中心，茂名 525099；4.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，茂名 525099；5.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广州 511400)

罗非鱼(Oreochromisniloticus)具有生长快、病害少、繁殖力强、食性杂等特点，且骨刺少、肉质厚，富含多种不饱和脂肪酸，是我国南方主要经济鱼种之一。2020年，我国罗非鱼总产量达165.5万t[1]，约占全球总产量的27%，出口总量达到44.73万t，出口额约12.45亿美元。然而，巨大的市场竞争力使得普通商品罗非鱼的市场价格低下，急需高品质的产品来打破罗非鱼养殖业同质化、低水平的现状。

鉴于广东中山脆肉鲩的成功，一部分专业养殖者开始着手于脆肉罗非鱼的养殖并取得了较好的成果。经蚕豆(ViciafabaL.)脆化的罗非鱼肌肉硬度和咀嚼性显著提升，具有肉质爽脆、无泥腥味等特点，适用于多种烹饪方式，其特殊的口感打破了消费者对罗非鱼鱼肉的传统认知，深受消费者青睐[2-3]。然而，在脆肉鲩养殖过程中，由于投喂的脆化饲料良莠不齐、营养不均衡，加上经粗加工的脆化饲料仍存在较多的生物碱、蚕豆凝集素、蚕豆嘧啶核苷、胰蛋白抑制剂等抗营养因子[4]，鱼体会表现出适口性差、饲料系数高、肠道损伤、肠道菌群失衡等问题，造成生长性能降低[5-7]。这可能也是制约脆肉罗非鱼养殖业发展的主要障碍。此外，前人有关脆化的研究大多采用投喂纯蚕豆、浸泡蚕豆或是蚕豆配合饲料的方式[5,8-10]，以添加蚕豆粉制成膨化饲料进行试验的报道很少。因此，本试验以吉富罗非鱼为试验对象，研究饲料中添加不同水平蚕豆对其生长性能、肠道消化酶活性、肠道形态和肠道菌群的影响，以期为脆肉罗非鱼养殖及脆化饲料的研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

以豆粕、菜籽粕为主要蛋白质源，豆油和磷脂为主要脂肪源，分别添加0(对照)、15%、30%和60%的蚕豆，并辅以大豆浓缩蛋白、鱼粉调整补充蛋白质使饲料配方中蛋白质水平一致，微量调整豆油比例使饲料配方中脂肪水平一致，配制4种等氮等脂试验饲料，分别命名为C0、C15、C30、C60。试验饲料组成及营养水平见表1。鲜蚕豆购于湖北某合作社，其营养成分含量(干物质基础)如下：粗蛋白质28.5%、粗脂肪0.8%、水分11.1%、粗灰分3.4%、淀粉43.0%、蛋氨酸0.2%、赖氨酸2.0%。所有饲料原料经粉碎并全部通过60目标准筛，混合均匀后通过T52水产饲料膨化机(华强膨化机械厂，广东)制成粒径为3 mm的膨化饲料(膨化温度为110 ℃)，喷油后经55 ℃烘干，置于4 ℃保存备用。

表1 试验饲料组成及其营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

续表1项目Items饲料DietsC0C15C30C60营养水平Nutrientlevels4)粗蛋白质Crudeprotein29.1829.1529.0929.20粗脂肪Crudelipid4.694.754.674.70粗灰分Ash8.388.468.428.36蛋氨酸Methionine0.400.440.410.41赖氨酸Lysine2.022.012.022.01

1.2 试验鱼和养殖管理

试验用吉富罗非鱼由广东罗非鱼良种场提供，在暂养池驯养1周后，选取初始体重约为500 g的吉富罗非鱼600尾，随机分为4组，分别命名为C0、C15、C30、C60组，每组3个重复，每个重复50尾鱼。养殖试验在广东省农业科学院白云基地池塘网箱中进行，网箱规格为1.5 m×1.5 m×2.0 m。4组试验鱼按照组名投喂对应的试验饲粮，采用饱食投喂方式，每天投喂2次(08:30和17:00)，每天记录饲料投喂量、试验鱼死亡情况及水质情况，试验期为100 d。养殖期间，采用自然光照，24 h供氧，水体中溶氧浓度>6.0 mg/L，氨氮浓度<0.05 mg/L，亚硝酸盐浓度<0.01 mg/L，温度在26～33 ℃。

1.3 样本采集

饲养试验结束后，禁食24 h，统计每个网箱中试验鱼的数量和总重量，计算终末体重、增重率、特定生长率和存活率；统计每个网箱中试验鱼的总摄食量，计算饲料系数、蛋白质效率和摄食量；每个重复随机取6尾试验鱼测定体长与体重，计算肥满度，分离肝脏并称重，计算肝体比；每个重复随机取3尾试验鱼的前肠于-80 ℃冰箱保存，用于测定消化酶活性；每个重复取2尾试验鱼的中肠固定于4%甲醛溶液，用于肠道形态分析；每个重复另取3尾试验鱼的后肠于同一EP管，-80 ℃保存，用于肠道菌群组成分析。

1.4 指标测定

1.4.1 生长性能与形态学指标计算

增重率(%)=100×[终末体重(g)-初始体重(g)]/初始体重(g)；特定生长率(%/d)=100×[ln终末体重(g)-ln初始体重(g)]/试验天数(d)；成活率(%)=100×终末成活尾数/初始总尾数；饲料系数=摄食量(g)/[(终末体重(g)-初始体重(g)]；蛋白质效率(%)=100×体重增加量(g)/饲料蛋白质摄取量(g，干物质基础)；摄食量(g/尾)=总摄食量(g)/[(初始尾数+终末尾数)/2]；肥满度(g/cm3)=100×体重(g)/体长(cm)3；肝体比(%)=100×肝脏重(g)/体重(g)。

1.4.2 肠道消化酶活性测定

所测肠道消化酶包括淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶。将肠道组织用生理盐水以1∶9的体积比进行稀释，获得肠道组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液测定淀粉酶和脂肪酶活性。另称取肠道组织样品，用胰蛋白酶匀浆液按照1∶9的体积比稀释，获取肠道组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液测定胰蛋白酶活性。上述肠道消化酶活性采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定，具体测定方法参考试剂盒说明书。

1.4.3 肠道形态分析

肠道组织在4%多聚甲醛中固定24 h后，进行脱水、透明和浸蜡包埋，制备石蜡组织切片并进行常规染色。待切片水化后浸入苏木精染色10 min，蒸馏水速洗，用0.1%盐酸乙醇分色，浸入1%伊红中染色2 min，再用盐酸乙醇分色，经95%乙醇与无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后，光镜下观察肠道组织的形态与病理学特征。

1.4.4 肠道菌群测定

用试剂盒提取肠道组织DNA后，以16S DNA“V3+V4”高变区的序列设计引物，进行肠道菌群总DNA的PCR扩增，所用引物为338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。采用MiSeq高通量测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质控和过滤。区分样本后进行操作分类单元(OTU)聚类分析和物种分类学分析，基于OTU进行alpha多样性分析，包括物种丰富度(Chao指数和Ace指数)和多样性(Shannon指数和Simpson指数)；基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构的统计分析。

1.5 数据处理与分析

采用SPSS 22.0统计软件中单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏多重比较法对试验结果的差异显著性进行分析处理。先对数据进行方差齐性检验，若不满足方差齐性，则采用Dunnett-T3检验法进行多重比较。试验结果用平均值±标准误(mean±SE)表示，显著性水平为P<0.05。肠道菌群相关数据分析均在I-Sanger云平台(www.i-sanger.com)上进行。

2 结果与分析

2.1 饲料中添加蚕豆对罗非鱼生长性能的影响

由表2可知，各组间罗非鱼的增重率、特定生长率、饲料系数、肝体比、肥满度和摄食量均无显著差异(P>0.05)。C60组的蛋白质效率和存活率显著高于C0和C15组(P<0.05)。

表2 饲料中添加蚕豆对罗非鱼生长性能的影响Table 2 Effects of faba bean supplementation on growth performance of Oreochromis niloticus

2.2 饲料中添加蚕豆对罗非鱼肠道消化酶活性的影响

由表3可知，各组间罗非鱼的肠道淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性均无显著差异(P>0.05)，但总体上均随蚕豆添加量的增加呈现先升后降的趋势，并在C30组取得最高值。

表3 饲料中添加蚕豆对罗非鱼肠道消化酶活性的影响Table 3 Effects of faba bean supplementation on intestinal digestive enzyme activities of Oreochromis niloticus

2.3 饲料中添加蚕豆对罗非鱼肠道形态的影响

由表4可知，与C0组相比，C15、C30和C60组罗非鱼肠道绒毛高度、绒毛宽度和肌层厚度均显著降低(P<0.05)。

表4 饲料中添加蚕豆对罗非鱼肠道形态的影响Table 4 Effects of faba bean supplementation on intestinal morphology of Oreochromis niloticus μm

各组罗非鱼肠道组织切片如图1所示。与C0组相比，C15、C30和C60组肠道绒毛上皮细胞脱落，固有层裸露，绒毛顶端自溶，结缔组织疏松，伴少量炎性细胞散在浸润，肌层细胞减少，肌层局部变窄。

图1 罗非鱼肠道组织切片(HE染色)Fig.1 Intestinal tissue slice of Oreochromis niloticus (HE staining,200×)

2.4 饲料中添加蚕豆对罗非鱼肠道菌群的影响

2.4.1 Venn图分析

由罗非鱼肠道菌群Venn图(图2)可知，C0、C15、C30和C60组的总OTU数目分别为935、984、815和812。各组共有的OTU数目为446，分别占总OTU数目的47.7%、45.3%、54.7%和54.9%；C0、C15、C30和C60组独有的OTU数目分别为147、186、93和53，分别占总OTU数目的10.16%、12.85%、6.43%和3.66%。

图2 罗非鱼肠道菌群Venn图Fig.2 Venn map of intestinal flora of Oreochromis niloticus

2.4.2 物种组成分析

门水平和属水平下罗非鱼肠道菌群的相对丰度如图3所示。在门水平上，优势菌群依次为蓝藻门(Cyanobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteriota)，这5个门在各组肠道菌群中所占比例均在90%以上。与C0组相比，C15、C30和C60组变形菌门的相对丰度降低；C15和C60组梭杆菌门的相对丰度降低，蓝藻门的相对丰度升高；各组放线菌门和厚壁菌门的相对丰度差异不大。在属水平上，相对丰度大于1%的菌群C0组有14个(检测到邻单胞菌属)，C15组有14个(检测到乳杆菌属)，C30组有14个(检测到邻单胞菌属)，C60组有13个。其中，与C0组相比，C15和C60组norank_f_norank_o_Chloroplast的相对丰度升高，鲸杆菌属(Cetobacterium)的相对丰度降低；C15、C30和C60组罗姆布茨菌属(Romboutsia)的相对丰度降低。

图3 门水平和属水平下罗非鱼肠道菌群的相对丰度Fig.3 Relative abundance in phylum and genus levels of intestinal flora of Oreochromis niloticus

2.4.3 alpha多样性

饲料中添加蚕豆对罗非鱼肠道菌群alpha多样性指数的影响如表5所示。各组罗非鱼肠道菌群的Shannon指数、Ace指数和Chao指数无显著差异(P>0.05)；C15、C30、C60组罗非鱼肠道菌群的Simpson指数均低于C0组，且C30组与C0组的差异达到显著水平(P<0.05)。

表5 饲料中添加蚕豆对罗非鱼肠道菌群alpha多样性指数的影响Table 5 Effects of faba bean supplementation on alpha diversity indexes of intestinal flora of Oreochromis niloticus

3 讨论

3.1 饲料中添加蚕豆对罗非鱼生长性能的影响

蚕豆在畜禽和水产养殖中的应用越来越广泛。Keller等[11]研究证实，蚕豆配合螺旋藻可以完全替代豆粕，对杂交公牛的生长和肥满度无显著影响。Sobotka等[12]研究显示，饲料中添加10%或者12%的蚕豆蛋白提取物能提高仔猪的日增重率和饲料效率。也有研究发现，饲料中添加浸泡蚕豆或蚕豆沉性颗粒料会抑制罗非鱼、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)、斑点叉尾(Ietaluruspunetaus)、异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)等的生长，同时会增大其饲料系数[8,13-14]。本试验结果表明，C15、C30和C60组罗非鱼的增重率和特定生长率与对照组即C0组罗非鱼的基本持平，说明投喂添加蚕豆的饲料对罗非鱼的生长无消极影响。这与陈度煌等[15]的研究结果类似，该研究发现1.5%蚕豆乙醇提取物组、1.5%蚕豆丙酮提取物组和基础饲料组罗非鱼的生长性能基本一致。这可能归因于本试验饲料中补充了不同剂量的蛋氨酸，使得各组饲料蛋氨酸含量基本维持在同一水平，削弱了蛋氨酸对生长的限制性。研究证实，大豆浓缩蛋白是由豆粕去除皂甙、大豆凝集素、胰蛋白酶抑制因子等抗营养因子后加工而成，其和鱼粉的表观消化率和蛋白质效率均高于菜籽粕和豆粕[16-17]，这很可能是C60组罗非鱼蛋白质效率高于对照组和C15组的原因。罗非鱼的存活率随蚕豆添加量的增加呈现升高的趋势并在C60组与对照组达到显著性水平，这可能是试验前期处于无乳链球菌的爆发期，而蚕豆中的缩合单宁能干扰微生物细胞壁多肽与巯基反应，使膜蛋白功能丧失，对变形链球菌有抑制作用[18-19]。因此，我们推测缩合单宁对无乳链球菌也具有一定的消杀作用，从而提高了罗非鱼的存活率。此外，各添加蚕豆组罗非鱼的肝体比随蚕豆添加量的升高呈现降低的趋势，这与姜维波[14]、郑小淼等[20]的研究结果相似，表明饲喂蚕豆会对肝脏等器官的发育起抑制作用。

3.2 饲料中添加蚕豆对罗非鱼肠道消化酶活性的影响

淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶等消化酶在动物对营养物质的消化方面发挥着重要作用，其活性严重影响着水产动物和陆生动物的消化水平。研究发现，饲粮中添加蚕豆会提高肉鸡盲肠对蛋白质的消化率[21]。郑小淼等[20]证实，浸泡蚕豆会显著降低草鱼肠道碱性蛋白酶和脂肪酶活性，提高α-淀粉酶活性。而李忠铭等[22]研究表明，蚕豆对鲤鱼肠道蛋白酶活性无显著影响，却会显著降低其淀粉酶活性。本试验结果表明，淀粉酶和胰蛋白酶随蚕豆添加量的增加呈现先上升后下降的趋势，并在C30组取得最大值，说明饲料中添加30%的蚕豆能提高罗非鱼的消化能力。与上述研究结果不一致的原因除了试验对象不同，可能还与饲料营养水平存在差异有关。研究发现，消化酶与食物之间并不单是消化酶对食物的单向作用，鱼类摄入食物营养成分的差异也会对机体消化酶的分泌和活性产生不同的作用，鱼类生长过程中会因其摄入食物营养成分的差异而影响不同组织的消化酶活性[23]。大量研究表明，适宜的淀粉水平对动物的消化酶活性有增强作用[24-25]。本研究中，饲料淀粉水平随蚕豆添加量的增加而逐渐升高，这可能是肠道部分消化酶活性得到增强的主要原因之一。

3.3 饲料中添加蚕豆对罗非鱼肠道形态的影响

鱼类肠道黏膜不仅可以消化吸收营养物质，同时还是机体重要的防御屏障之一[26]。其中，黏膜层的柱状细胞即微绒毛结构中含有多种消化酶，能有效增大肠道表面的吸收面积。张振男等[6]研究显示，用蚕豆饲喂草鱼，早期肠道黏膜上皮会出现炎症，表现为微绒毛逐渐稀疏、变短；试验后期肠道黏膜上皮部分区域微绒毛消失，细胞间紧密连接暴露，上皮细胞表面遭到损坏。造成肠道结构破坏的原因之一是摄食蚕豆后，试验鱼肠道中的革兰氏阴性菌数量增多，其毒性物质脂多糖含量增加，继而试验鱼肠道出现炎症反应。靳雅琦等[27]研究也发现，经纯蚕豆饲喂的草鱼肠绒毛变短，霍乱弧菌等致病菌数量增多。本试验结果与上述研究结果类似，相比于对照组，各添加蚕豆组罗非鱼肠道绒毛高度、肌层厚度和绒毛宽度均显著降低，造成此结果的原因可能是蚕豆虽经高温膨化处理，仍存在一部分蚕豆凝集素。研究证实，蚕豆凝集素较其他豆科凝集素更稳定，能与肠道表面结合，引起上皮细胞微绒毛萎缩，抑制上皮细胞增殖[28]。

3.4 饲料中添加蚕豆对罗非鱼肠道菌群的影响

肠道内复杂的菌群系统既能影响饲料营养素的高效利用,又能调控宿主的正常生理功能[7]。研究发现，罗非鱼肠道的优势菌群为梭杆菌门、变形菌门、厚壁菌门和放线菌门[29]。梭杆菌门下的鲸杆菌属可参与鱼体内维生素B12的合成以及多肽碳水化合物的发酵[30]。本研究发现，C15和C60组罗非鱼肠道菌群中鲸杆菌属的相对丰度低于对照组，说明添加15%和60%的蚕豆可能会影响罗非鱼的造血功能和糖类代谢能力。变形菌门广泛存在于动植物体和自然环境中，其数量的增加是菌群失调和疾病风险的潜在诊断标志[31]。本研究中，C15、C30和C60组罗非鱼肠道菌群中变形菌门的相对丰度低于对照组，可能意味着添加蚕豆能改善罗非鱼肠道菌群结构。邻单胞菌属是条件致病菌，可导致鱼摄食减少、脾脏肿大和腹腔积水等[32]。乳杆菌属是一种重要的有益菌，能改善肠道菌群组成，抑制病原菌生长[29-30]。本研究中，邻单胞菌属存在于对照组和C30组，乳杆菌属只出现在C15组，这可能是C15组肠道虽然损伤最严重，但仍有较高的增重率和消化酶活性的原因之一。

肠道物种的alpha多样性分析可以反映微生物群落的丰富度和和多样性。本研究发现，相比于对照组，C30组的Simpson指数显著降低，C15和C60组的Simpson指数也有所降低，且C30和C60组的Ace指数和Chao指数呈现下降趋势，这与张振男等[6]在草鱼上的研究结果一致，说明添加超过30%的蚕豆会降低肠道菌群的多样性。而林科涛[7]的研究结果显示，蚕豆会提高草鱼肠道菌群的多样性，这种不同研究结果的差异可能是养殖环境和鱼的种类不同造成的。