饲粮钙水平对5～8周龄怀乡鸡生长性能、骨骼特性及钙磷代谢的影响

何雪萍 范海丹 陈静文 尹福泉 杜炳旺 王润莲

(广东海洋大学滨海农业学院，湛江 524088)

钙作为动物体必需的常量元素，对骨骼和牙齿的形成、神经和肌肉兴奋性及多种酶的活性至关重要，饲粮钙含量不足或钙磷比不适容易导致家禽骨骼发育不良或腿部疾病，这是家禽生产中造成经济损失的主要营养问题之一[1]。研究怀乡鸡饲粮中适宜的钙水平，对怀乡鸡的规范饲养及地方标准制定具有重要的意义。我国现行《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)[2]的钙需要量主要参考NRC(1994)[3]，规定了快大型肉鸡及黄羽肉鸡的钙需要量，但现代肉鸡品种繁多，其生长潜力、饲料转化效率、骨骼结构特点以及肉品质等方面和之前相比存在较大差异[4]，因此，不同肉鸡品种的实际钙需要量可能与早期制定的肉鸡标准有一定出入。近年来，先后有许多研究在白羽肉鸡、黄羽肉鸡及爱拔益加(AA)肉鸡上进行了钙需要量评定工作[5-16]，但更多的是针对快速生长肉鸡前期阶段钙需要量的研究，就慢速型生长的地方肉鸡以及肉鸡中后期阶段钙需要量的研究不多，有文献建议根据地方肉鸡的产肉特点制定相应的营养标准[17]。近年发布的黄羽肉鸡农业行业标准《黄羽肉鸡营养需要量》(NY/T 3645—2020)[18]给出了慢速型黄羽肉鸡1～30日龄、31～60日龄、61～90日龄及90日龄以上各阶段的钙需要量，但其中仅明确了肉鸡的生长性能指标，未见对肉品质、骨骼性能等其他性能的描述以及对钙、磷等矿物质需要量的确定依据。本课题组前期研究发现，饲粮不同钙水平对8周龄末怀乡鸡屠宰性能没有明显的影响，仅个别体尺指标呈显著性变化，支撑数据有限，该试验结果仅给出了怀乡鸡生长后期饲粮钙水平的参考范围[19]。怀乡鸡是华南地区著名的肉鸡品种，是一种慢速生长的地方肉鸡，具有优良肉品质和独特的骨骼特点[20]。有研究表明，满足怀乡鸡骨骼生长的饲粮磷水平高于黄羽肉鸡标准[21]，因此推测其饲粮钙水平也可能和黄羽肉鸡标准有一定出入。关于钙需要量的研究多以生长性能、骨骼性能、血清钙磷代谢指标为评定依据[5-15]。近期的一项报道发现骨骼钙代谢的分子标记物也可敏感评价肉鸡钙营养状况[16]。因此，本试验以怀乡鸡为研究对象，考察饲粮钙水平对怀乡鸡生长性能、骨骼特性、钙磷代谢指标及骨骼钙代谢标记物基因表达的影响，以探讨反映怀乡鸡钙营养状况的敏感指标，评定5～8周龄怀乡鸡饲粮中钙的适宜水平。

1 材料与方法

1.1 试验设计与动物分组

采用完全随机试验设计，将240只28日龄体重[(381.66±5.68) g]均一的怀乡鸡(公鸡)，随机分为5个组(每组6个重复，每个重复8只鸡)，分别饲喂5个不同钙水平的试验饲粮，进行饲养试验，持续28 d，期间观测生长和耗料情况，饲养试验末取血液和骨骼样品进行生化和分子表达指标分析。

1.2 试验饲粮

采用玉米-豆粕型基础饲粮，饲粮营养水平参考我国《黄羽肉鸡营养需要量》[18]以及与怀乡鸡生长、产肉性能相近的地方品种鸡的营养参数[2,9-10]确定。基础饲粮含钙0.75%，通过改变基础饲粮中沸石粉和贝壳粉的用量调整饲粮钙水平，配制其他4个钙水平(0.85%、0.95%、1.05%和1.15%)饲粮，各组饲粮钙水平的实际测定值分别为0.75%、0.85%、0.96%、1.05%和1.14%，非植酸磷水平均为0.40%，其他营养成分(代谢能、粗蛋白质、氨基酸等)的水平也完全一致。5～8周龄怀乡鸡基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 5～8周龄怀乡鸡基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet for Huaixiang chickens at 5 to 8 weeks of age (air-dry basis) %

1.3 饲养管理

试验鸡采用3层叠式金属笼进行笼养，饲养全程自由采食和饮水，温度稳定在25～26 ℃，相对湿度保持在60%～65%，每天清1次粪便，每天观察鸡只精神状态，记录病死情况，及时淘汰病鸡，计算耗料情况，试验开始及8周龄末以重复为单位称鸡空腹重，每周统计采食量。

1.4 血液采样与指标测定

饲养试验末，将试验鸡空腹12 h后，从各个重复中选取接近平均体重的2只鸡，称取活体重后，翅静脉采血各4 mL，合为1个样品，离心(离心力1 008×g，SN-LSC-1离心机)10 min获得血清，测定血清钙、磷含量和碱性磷酸酶活性。检测方法严格按照南京建成生物工程研究所生产的试剂盒及说明书进行。

1.5 骨骼采样与指标测定

试验鸡采血后屠宰，按照陈静文等[21]所述方法进行胫骨和中趾骨取样，制成风干骨骼样品，并采用国家标准方法[22]测定其灰分、钙及磷含量(722型可见分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

1.6 胫骨碱性磷酸酶基因表达测定

采集右侧胫骨于-196 ℃液氮中速冻后，-80 ℃冰箱冻存，按Zhang等[23]描述的步骤采用实时荧光定量PCR法测定碱性磷酸酶的mRNA相对表达量。提取胫骨RNA，检测RNA纯度、浓度和完整性(NanoDrop 2000超微量分光光度计和安捷伦2100生物分析仪)，对可用的RNA进行反转录，进行实时荧光定量PCR(Applied Biosystems7500，美国)。以β-肌动蛋白为内参基因，以不同处理的混合样作为对照，采用2-ΔΔCt法计算碱性磷酸酶mRNA相对表达量[24]。PCR引物信息见表2。

表2 PCR引物信息Table 2 Information of primers for PCR

1.7 养分表观代谢率

饲养试验结束后进行代谢试验。从饲养试验中的各组选取体重相近的6只鸡转入代谢试验笼内，分别饲喂相应组的试验饲粮，预饲3 d使鸡只适应新的环境，每天正常饲喂和饮水，观察鸡只的采食和排粪尿情况，预饲第3天20:00停食不停水，第4天08:00称重，开始正试试验，正试期为3 d，采用全收粪方法，每天饲喂和饮水并收集排泄物，称重后立即放入65～70 ℃的烘箱中烘干，最后将3 d的排泄物放在一起65～70 ℃烘干，测定初水分并制成分析样品。另外采集各组试验饲粮样品，制成分析样品。按照国家标准方法[22]测定饲粮和排泄物样品中干物质、粗灰分、钙、磷含量，按照下式计算养分表观代谢率：

某养分表观代谢率(%)=[(摄入该养分量-排泄物该养分量)/摄入该养分量]×100。

1.8 统计分析

试验数据以平均值±标准差表示。方差分析前对所有数据先进行方差齐性检验和正态性检验，数据符合正态分布。采用SAS软件的一般线性模型(GLM)进行单因素方差分析，采用LSD法进行组间差异显著性检验。用不相关比较法(Orthogonal)分析各差异显著指标随饲粮钙水平变化的线性或曲线反应，采用二次曲线模型、线性折线模型及二次折线模型进行曲线拟合分析[21,24-26]，其钙水平采用实测值。根据二次曲线模型的拐点、线性折线及二次折线模型转折点效应值对应的钙水平求得钙的需要量。方差分析和曲线拟合的显著水平为P<0.05，0.05≤P<0.10为存在变化趋势。

2 结果与分析

2.1 生长性能

由表3可知，怀乡鸡5～8周龄的末重、平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和耗料增重比(F/G)在不同的钙水平组间无显著差异(P>0.05)。

表3 饲喂不同钙水平饲粮怀乡鸡的生长性能Table 3 Growth performance of Huaixiang chickens fed diets with different Ca levels

2.2 胫骨特性

由表4可知，胫骨折断力、胫骨灰分含量、胫骨灰分磷含量和胫骨脱脂钙磷比在不同的钙水平组间无显著差异(P>0.05)，但饲粮钙水平对怀乡鸡胫骨灰分钙含量有显著影响(P<0.05)。趋势分析表明，胫骨灰分钙含量随饲粮钙水平呈显著的二次曲线变化(P<0.05)，其最佳拟合方程(y=-56.12x2+109.80x-18.10，R2=0.48)为二次曲线模型，据此评价怀乡鸡饲粮中适宜的钙水平为0.98%。

表4 饲喂不同钙水平饲粮怀乡鸡的胫骨特性Table 4 Tibia characteristics of Huaixiang chickens fed diets with different Ca levels

2.3 趾骨特性

由表5可知，趾骨灰分含量、趾骨灰分磷含量和趾骨脱脂钙磷比在不同的钙水平组间无显著差异(P<0.05)，唯有趾骨灰分钙含量组间存在差异显著(P>0.05)。趋势分析表明，趾骨灰分钙含量随饲粮钙水平的升高呈显著的线性变化(P<0.05)，但有二次曲线变化的趋势(P=0.079)，其最佳拟合方程(y=-18.64x2+31.15x+25.22，R2=0.92)为二次曲线模型。

表5 饲喂不同钙水平饲粮怀乡鸡的趾骨特性Table 5 Toe characteristics of Huaixiang chickens fed diets with different Ca levels

2.4 血清钙磷代谢指标及胫骨碱性磷酸酶mRNA相对表达量

由表6可知，血清磷含量、钙磷比、碱性磷酸酶活性在不同的钙水平组间无显著差异(P>0.05)，但血清钙含量及胫骨碱性磷酸酶mRNA相对表达量组间存在差异显著(P<0.05)，说明两者可敏感反映怀乡鸡体内钙的营养状况。趋势分析表明，血清钙含量及胫骨碱性磷酸酶mRNA相对表达量随饲粮钙水平的升高呈显著的二次曲线变化(P<0.05)，其中血清钙含量的最佳拟合方程(y=-12.71x2+24.60x+13.31，R2=0.77)为二次曲线模型，胫骨碱性磷酸酶mRNA相对表达量的最佳拟合方程[y=1.15-1.16×(0.90-x)，R2=0.99]为线性折线模型。

表6 饲喂不同钙水平饲粮怀乡鸡的血清钙磷代谢指标及胫骨碱性磷酸酶mRNA相对表达量Table 6 Serum Ca and P metabolic indices and tibia ALP mRNA relative expression level of Huaixiang chickens fed diets with different Ca levels

续表6项目Items饲粮钙水平DietaryCalevel/%0.750.850.951.051.15P值P-value钙水平Calevel线性Linear二次曲线Quadratic胫骨碱性磷酸酶mRNA相对表达量TibiaALPmRNArelativeexpressionlevel1.32±0.05a1.21±0.04ab1.16±0.03b1.15±0.03b1.16±0.03b0.0150.0710.008

2.5 养分表观代谢率

由表7可知，饲粮钙水平对干物质和磷表观代谢率没有显著影响(P>0.05)，但对粗灰分和钙表观代谢率有显著影响(P<0.05)。趋势分析表明，粗灰分和钙表观代谢率随饲粮钙水平的升高呈显著的二线曲线变化(P<0.05)，二者的最佳拟合方程[粗灰分表观代谢率:y=-128.17x2+251.00x-104.93(R2=0.87)；钙表观代谢率：y=-72.00x2+139.71x-28.99(R2=0.84)]均为二次曲线模型。

表7 饲喂不同钙水平饲粮怀乡鸡的养分表观代谢率Table 7 Apparent metabolic rates of nutrients of Huaixiang chickens fed diets with different Ca levels %

2.6 敏感指标拟合方程确定钙需要量

将各敏感指标的最佳拟合方程汇总为表8。由表8可知，随着饲粮钙水平的升高，胫骨和趾骨灰分钙含量、血清钙含量、粗灰分和钙表观代谢率均呈二次曲线变化，胫骨碱性磷酸酶mRNA相对表达量呈线性折线变化，据此求得怀乡鸡饲粮钙适宜水平分别为0.98%、0.84%、0.97%、0.98%、0.97%、0.90%，为确保满足钙磷代谢及骨骼生长需要，取最大值0.98%为5～8周龄怀乡鸡钙需要量。

表8 敏感指标拟合方程确定钙需要量Table 8 Fitted equations of sensitive indices to acquire Ca requirement for Huaixiang chickens

3 讨 论

不同家禽及同一种家禽在不同的生长阶段对钙的需要量不同[2-3]。我国目前饲养的肉鸡主要有3种类型：生长速度快的快大型肉鸡、慢速生长的地方肉鸡及其杂交品种[4]。怀乡鸡是一种慢速生长的地方肉鸡鸡种，具有独特的外观特点、胴体性能和肉品质与风味，深受华南和周边地区欢迎[20]。怀乡鸡的饲养一般分为3个生长阶段：0～4周龄、5～8周龄、9～17周龄，17周龄上市，体重达1 500 g[20]。为科学配制怀乡鸡饲粮以实现标准化饲养，本试验研究了怀乡鸡5～8周龄阶段饲粮钙适宜水平。

敏感指标的选择是营养需要量评定的关键因素之一。已有研究多以生长性能、骨骼性能、血清钙磷代谢指标评定钙需要量，如早期在白羽肉鸡、岭南黄羽肉鸡、贵妃鸡及麒麟鸡上的研究[6-10]及近期在AA肉鸡上的报道[11-16]。另有报道指出，碱性磷酸酶与骨骼钙磷代谢密切相关，其活性可用于评价蛋鸭的钙需要量[27]；最新的一项研究发现，骨骼碱性磷酸酶作为钙代谢的标记物，其转录水平也可敏感评价肉鸡钙营养状况[14,16]。本试验综合上述生长性能、骨骼特性、血清钙磷代谢指标及碱性磷酸酶基因分子表达指标，探讨其剂量效应规律，评定怀乡鸡5～8周龄阶段的钙需要量。结果表明，胫骨和趾骨灰分钙含量、血清钙含量、胫骨碱性磷酸酶mRNA相对表达量、粗灰分和钙表观代谢率均随着饲粮钙水平的升高呈显著的二次曲线变化，拟合分析求得饲粮适宜钙水平为0.84%～0.98%。根据前人报道[13-14]，一般选取其中最大值为需要量，以确保满足所有钙磷代谢指标及骨骼生长需要，故建议该阶段怀乡鸡饲粮中钙水平为0.98%。

拟合模型的选择对剂量效应反应法判断适宜的养分需要量非常关键。不同的曲线模型有其特定的变化规律，适合于不同的数据分布特点[25]。陈丽欣等[26]对肉鸡和肉鸭饲粮钙水平与胫骨灰分含量的剂量效应反应数据进行了7种常用模型的比较，发现综合所有拟合数据的拟合程度和最佳拟合出现的频度，二次曲线、线性折线和二次折线模型拟合效果优于其他模型，因此，本试验研究中采用了该3种拟合模型进行曲线拟合。

综合以上敏感指标(骨骼灰分钙含量、血清钙含量及胫骨碱性磷酸酶mRNA相对表达量、粗灰分和钙表观代谢率)，得出其饲粮适宜钙水平为0.84%～0.98%，取最大值确保满足所有钙磷代谢指标及骨骼生长需要，因此，怀乡鸡5～8周龄饲粮钙水平为0.98%时可获得最佳的骨骼性能及钙磷代谢。我国《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)[2]和NRC(1994)[3]建议的快大型肉鸡和黄羽肉鸡5～8周龄阶段钙需要量均为0.90%，新近发布的黄羽肉鸡农业行业标准《黄羽肉鸡营养需要量》(NY/T 3645—2020)[18]建议31～60日龄阶段的钙需要量为0.72%[18]，可见，试验得出的怀乡鸡5～8周龄阶段饲粮钙适宜水平高于快速生长肉鸡和黄羽肉鸡的钙需要量。另外，与快大型肉鸡和快速型岭南黄羽肉鸡同一阶段的结果相比，也有不同程度偏高，如蒋守群等[5]和洪平等[7-8]指出，4～6周龄岭南黄羽肉鸡在饲粮钙水平为0.90%时，对改善胫骨性能的效果较好；近期一项研究得出快大型肉鸡4～6周龄饲粮钙水平推荐量为0.72%[14]。但以往报道的一些慢速生长的地方肉鸡的钙需要量结果与本试验结果类似，其饲粮适宜钙水平均高于标准推荐量，如潘文等[9]指出，1～49日龄贵妃鸡饲粮适宜钙水平为1.10%；赵玉振等[11]报道麒麟鸡1～28日龄饲粮钙需要量为1.18%，分析原因可能与地方肉鸡的生长环境和养分利用率偏低[1]有关。

4 结 论

① 胫骨和趾骨灰分钙含量、血清钙含量、胫骨碱性磷酸酶mRNA相对表达量、粗灰分和钙表观代谢率可作为5～8周龄怀乡鸡钙需要量评定的敏感指标。

② 建议5～8周龄怀乡鸡饲粮钙水平为0.98%。