模拟失重下微血管内皮细胞通过外泌体转运miR-223-3p抑制成骨细胞分化的研究

张晓雁，徐丽群，张丽君，唐 浩，李 萌，孙 权，薛 桐，胡泽兵，曹新生，石 菲，张 舒

(空军军医大学航空航天医学系航空航天生物动力学教研室，航空航天医学教育部重点实验室，陕西 西安 710032)

航天失重环境打破骨形成和骨吸收之间的平衡，导致严重的骨质丢失[1]。研究表明骨内微血管在骨稳态中发挥关键作用，血管生成先于骨形成，是骨化的先决条件；此外，骨内微血管是骨与邻近组织的沟通网络，提供营养物质，清除代谢废物，表明血管生成和骨形成之间存在紧密的时空联系，这种联系被称为“血管-成骨耦联”[2]。骨内微血管及血管生成减少可导致骨形成障碍，骨量减少，骨折愈合能力降低[2]。已有文献报道模拟失重下微血管内皮细胞可调控成骨细胞功能[3]，但具体机制尚未阐明。外泌体是一种直径为30～150 nm、具有脂质双分子层的膜性囊泡，可通过转运核酸、蛋白质和其他调控因子到受体细胞中发挥调控作用，参与体内免疫应答、骨重建、血管生成等多种生理活动[4-5]。在骨重塑微环境中，外泌体可向成骨细胞递送微小RNA(microRNA，miRNA)进而影响骨形成[6]。miRNA是一类由约22个核苷酸组成的非编码RNA，与靶基因的mRNA特异性结合，在转录后水平参与调控基因表达，以调节多种生物学过程[7]。本课题组研究发现，miRNA可参与调控成骨细胞功能，如miR-132-3p、miR-139-3p、miR-320-3p等[8-10]。前期，我们对模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体进行了miRNA芯片分析，结果显示模拟失重组外泌体内miR-223-3p表达丰富。文献[11]报道miR-223-3p可参与调控骨髓间充质干细胞的成骨分化。本研究拟在前期工作基础上，以小鼠微血管内皮细胞系bEnd.3细胞和小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1细胞为研究对象，探究模拟失重下微血管内皮细胞通过外泌体转运miR-223-3p是否可调控成骨细胞分化功能。该研究将有助于从“血管-成骨耦联”的角度，深化对失重性骨质丢失发生机制的认识，为失重性骨质丢失防治提供新的干预靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

小鼠微血管内皮细胞系bEnd.3(中国科学院上海细胞库)，小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1(中国科学院上海细胞库)，DMEM培养基、α-MEM培养基、胎牛血清、青-链霉素双抗、胰蛋白酶(Gibco公司)，2D回转器(中国航天员科研训练中心)，mimic-223-3p、inhibitor-223-3p及相应的阴性对照(上海吉玛制药技术有限公司)，RNAiso Plus细胞裂解液、SYBR®PremixExTaqTM、Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、Prime Script®RT reagent Kit(TaKaRa公司)，PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)，M-PER哺乳动物蛋白抽提试剂、BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司)，预制胶、PVDF膜(美国Invitrogen公司)，碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)测试盒(南京建成生物工程研究所)，BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒、DiI、Actin-Tracker Green、DAPI染色液(中国碧云天公司)，0.4 cm间隙电击杯、电穿孔系统、qRT-PCR仪、酶标仪(美国Bio-Rad公司)，ECL发光检测试剂盒(Merck Millipore公司)，化学发光仪(Tanon-4200，上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和体外分化 在37 ℃培养箱中(50 mL/L CO2、950 mL/L湿度)，用含有100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青-链霉素的DMEM高糖培养基常规培养bEnd.3细胞，用含有100 mL/L胎牛血清、10 mL/L青-链霉素的α-MEM培养基常规培养MC3T3-E1细胞。研究成骨细胞分化功能时，用成骨诱导培养基(含有100 mL/L胎牛血清，10 mL/L青-链霉素，100 nmol/L地塞米松，50 mg/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠的α-MEM培养基)常规培养MC3T3-E1细胞。实验均用第4～8代的细胞，所有实验均重复3次。

1.2.2 细胞模拟失重实验 2D回转器用于模拟地面细胞的失重环境，将bEnd.3细胞以适当的密度接种于回转培养瓶中常规培养。待细胞贴壁后，将培养瓶灌满培养基并加塞，确保完全去除气泡。然后，将培养瓶放入2D回转器中，以24 r/min的速度绕水平轴回转48 h，此为失重组(Clino组)。对照组(Con组)置入同一环境中静置培养相同时间，不进行回转。

1.2.3 外泌体分离与鉴定 模拟失重48 h后分别收集Clino组与Con组bEnd.3细胞培养基，在4 ℃条件下，依次300g离心10 min收上清、2 000g离心10 min收上清、1×104g离心30 min收上清，将上清置于超高速离心机1×105g离心70 min，弃上清，沉淀即为外泌体，PBS重悬后，再次1×105g离心70 min洗涤，沉淀用PBS重悬后可用于后续实验，保存于-80 ℃，避免反复冻融。利用透射电镜(HT-7700，日本Hitachi公司)观察外泌体形态。使用粒径分析仪(N30E，中国NanoFCM公司)检测外泌体粒径分布。利用蛋白质印迹检测外泌体的表面标记物，如Calnexin(1∶2 000；中国万类生物科技公司)、CD9和TSG101(1∶1 000；Proteintech，美国)。将外泌体分为Con Exos组和Clino Exos组。

1.2.4 细胞摄取外泌体 取500 μL外泌体置于1.5 mL离心管中，涡旋30 s，向其中加入DiI(1∶500；中国碧云天公司)，在37 ℃暗室中染色30 min。以1×105g离心70 min，弃上清，用200 μL PBS重悬外泌体并涡旋60 s。将染色后的外泌体加入MC3T3-E1细胞中，3 h后用PBS冲洗3次，40 g/L多聚甲醛固定细胞10 min，然后进行免疫荧光染色。

1.2.5 细胞转染 将MC3T3-E1细胞以适当的密度传至六孔板，用有血清无双抗的培养基常规培养过夜，细胞密度为60%～80%时转染。使用Lipofectamine 2000将mimic-223-3p(40 nmol/L)、inhibitor-223-3p(80 nmol/L)及其相应的阴性对照转染至MC3T3-E1细胞，无血清无双抗培养基培养6～8 h后更换为有血清无双抗培养基常规培养。细胞分组为：mimic-NC组、mimic-223-3p组、inhibitor-NC组、inhibitor-223-3p组。RNA Oligo序列见表1。

表1 RNA Oligo序列

1.2.6 外泌体电转miRNA 取蛋白浓度为1 g/L的外泌体，分别加入33 μg mimic-223-3p或mimic-NC，33 μg inhibitor-223-3p或inhibitor-NC，充分溶解后将外泌体转移至间隙为0.4 cm的电击杯中，以700 V/150 mF脉冲2次。电转完成后，将外泌体静置于冰上30 min。用RNase处理外泌体以去除可能结合到外泌体膜上的miRNA。随后，用PBS洗涤外泌体3次，1×105g离心70 min，去除未电转的游离核酸，PBS重悬外泌体并涡旋60 s。

1.2.7 实时荧光定量PCR 用RNAiso Plus提取bEnd.3细胞和MC3T3-E1细胞总RNA，并逆转录为互补DNA(cDNA)。使用PrimeScriptTMRT Master Mix Kit或Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit将RNA逆转录成cDNA，以GAPDH或U6作为内参基因。采用CFX96 real-time PCR检测系统和SYBR®PremixExTaqTMⅡ检测mRNA和miRNA的表达水平，采用Ct(2-ΔΔCt)计算样本间miRNA或mRNA的相对表达量。PCR引物序列见表2。

表2 基因引物序列

1.2.8 Western blotting分析 胰酶消化收集细胞，加入含100 mL/L蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液提取MC3T3-E1细胞总蛋白。超声裂解蛋白样本，在4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min并吸取上清后进行BCA定量。按照Western blotting操作说明进行凝胶电泳，转膜。室温下50 g/L脱脂牛奶封闭2 h后与特异性一抗4 ℃孵育过夜。使用一抗如下：GAPDH(1∶1 000；Cell Signaling Technology，美国)，Runx2(1∶1 000；Cell Signaling Technology，美国)和Ocn(1∶2 000；Abcam，英国)。然后，洗膜，将膜与二抗孵育2 h(1∶5 000；中杉金桥公司，中国)，使用凝胶成像系统拍照。利用ImageJ软件进行定量分析。

1.2.9 ALP活性测定 将MC3T3-E1细胞胰酶消化收集后加入含有100 mL/L蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，超声裂解后在4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min吸取上清，使用BCA定量法测定蛋白样品浓度。使用ALP检测试剂盒检测上清液中的ALP活性，37 ℃孵育15 min后加入显色剂，以苯酚为标准溶液，ddH2O作为空白对照溶液测定溶液A520 nm值。

1.2.10 ALP染色 本研究使用BCIP/NBT ALP显色试剂盒进行ALP染色。细胞弃去原培养基用PBS冲洗，40 g/L多聚甲醛固定15 min后用PBS冲洗3次，每次5 min。将BCIP/NBT染色工作液加到每个孔中，室温避光孵育30 min。去除工作液，ddH2O洗涤2次终止显色反应。数码相机拍照获取图像。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 外泌体的分离鉴定及摄取

将bEnd.3细胞置于2D回转器中培养48 h，收集细胞培养上清，采用低温超高速离心法提取外泌体。透射电镜下可观察到提取的两组外泌体均呈典型的茶杯样结构(图1A)。纳米流式分析两组外泌体平均粒径分别为78.83 nm和77.56 nm(图1B)。Western blotting检测两组外泌体中均有外泌体经典膜分子标志物CD9和TSG101表达，均未检测到外泌体阴性标志物Calnexin(图1C)。利用DiI分别标记两组外泌体，将外泌体与MC3T3-E1细胞共培养，共聚焦显微镜下可观察到两组外泌体均可被MC3T3-E1细胞摄取(图1D)。qRT-PCR实验表明外泌体与MC3T3-E1细胞共培养后，Clino Exos组MC3T3-E1细胞中miR-223-3p表达显著升高(P<0.05，图1E)。

A：模拟失重处理bEnd.3细胞48 h后提取细胞培养上清中外泌体，透射电镜观察外泌体形态，标尺为100 nm；B：纳米流式分析外泌体直径分布；C：Western blotting检测外泌体和细胞中的外泌体标志物(CD9，TSG101)和细胞标志物(Calnexin)；D：共聚焦显微镜观察MC3T3-E1细胞摄取外泌体，标尺为50 μm；E：qRT-PCR测定外泌体处理的MC3T3-E1细胞中miR-223-3p表达。 aP<0.05。

2.2 miR-223-3p抑制成骨细胞分化

为了探究miR-223-3p在成骨细胞分化中的作用，向MC3T3-E1细胞中转染mimic-NC，mimic-223-3p，inhibitor-NC或inhibitor-223-3p。结果表明，与mimic-NC组相比，mimic-223-3p组ALP、Ocn、Runx2 mRNA水平表达显著下降，且Ocn、Runx2蛋白水平也显著下调(P<0.05，P<0.01，图2A～B)；与inhibitor-NC组相比，inhibitor-223-3p组ALP、Ocn、Runx2 mRNA水平表达升高(P<0.01)，且Ocn、Runx2蛋白水平也显著上调(P<0.05，P<0.01，图2A～B)。ALP活性检测及ALP染色检测结果与qRT-PCR、Western blotting结果一致(P<0.01，图2C～D)，提示miR-223-3p抑制成骨细胞分化。

A：转染mimic-NC、mimic-223-3p、inhibitor-NC、inhibitor-223-3p后MC3T3-E1细胞中的ALP、Ocn、Runx2的mRNA表达；B：Western blotting测定MC3T3-E1细胞中的Ocn和Runx2蛋白表达；C：ALP活性检测；D：ALP染色，染色深表示ALP表达量高，染色浅表示ALP表达量低。 aP<0.05， bP<0.01。

2.3 外泌体可传递miR-223-3p抑制成骨细胞分化

将mimic-NC或mimic-223-3p电转到Con Exos中，然后将两组电转外泌体与MC3T3-E1细胞共培养。qRT-PCR和Western blotting结果显示，与mimic-NC组相比，mimic-223-3p组ALP、Ocn、Runx2 mRNA水平表达显著下降，且Ocn、Runx2蛋白水平也显著降低(P<0.05，P<0.01，图3A～B)。ALP活性检测及ALP染色检测也呈现相同的结果(P<0.05，图3C～D)。这些结果表明，外泌体可传递miR-223-3p抑制成骨细胞分化。

2.4 抑制miR-223-3p可缓解模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体对成骨细胞分化的抑制

将inhibitor-NC或inhibitor-223-3p电转到Clino Exos中，然后将两组电转外泌体与MC3T3-E1细胞共培养。结果表明，与inhibitor-NC组相比，电转inhibitor-223-3p组外泌体显著增加了MC3T3-E1细胞中Ocn、Runx2的mRNA和蛋白水平(P<0.05，P<0.01，图4A～B)。此外，ALP mRNA、ALP活性以及ALP染色也得到了相同的结果(P<0.05，图4A，图4C～D)，提示沉默miR-223-3p可有效缓解模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体对成骨细胞分化的抑制。

A：Con Exos电转mimic-NC、mimic-223-3p后与MC3T3-E1细胞共培养ALP、Ocn、Runx2的mRNA表达；B：Western blotting测定MC3T3-E1细胞的Ocn和Runx2蛋白表达；C：ALP活性检测；D：ALP染色，染色深表示ALP表达量高，染色浅表示ALP表达量低。 aP<0.05， bP<0.01。

A：Clino Exos电转inhibitor-NC、inhibitor-223-3p后与MC3T3-E1细胞共培养ALP、Ocn、Runx2的mRNA表达；B：Western blotting测定MC3T3-E1细胞的Ocn和Runx2蛋白表达；C：ALP活性检测；D：ALP染色，染色深表示ALP表达量高，染色浅表示ALP表达量低。 aP<0.05， bP<0.01。

3 讨论

失重环境导致的骨质丢失尚未发现具有自限性，且随着时间延长不断加重，因此失重性骨质丢失是限制长期载人航天任务的主要因素之一[12]。骨骼是高度血管化的组织，其中的血液循环和血管再生对于骨骼的生长与发育、塑形与重塑、损伤愈合至关重要[13]。骨内微血管不仅为骨骼细胞提供氧气、营养物质、内分泌激素等，并且内皮细胞能够通过分泌各种细胞因子与成骨细胞、破骨细胞等形成直接或间接的广泛联系，从而耦联血管新生与骨形成[2]。多项研究发现，微血管内皮细胞可促进共培养的骨髓间充质干细胞的成骨向分化[14-15]。此外，在Transwell小室共培养条件下，微血管内皮细胞能够显著促进MC3T3-E1细胞的增殖，并抑制其凋亡[16]。有文献[3]报道，模拟失重下人微血管内皮细胞的条件培养基抑制人原代成骨细胞的增殖和分化功能，表明模拟失重可通过影响微血管内皮细胞与成骨细胞的胞间通讯，从而间接干预成骨细胞功能。因此，我们从“血管-成骨耦联”的角度，探索了模拟失重下微血管内皮细胞对成骨细胞的调控作用及其可能机制。

外泌体介导的细胞间信息交流被认为是细胞-细胞间信息交流的重要方式。外泌体可通过直接与靶细胞胞膜融合进入细胞质、通过内吞作用被靶细胞摄取以及识别细胞表面的特异性受体，对靶细胞内的生理活动进行调节[17]。同时外泌体还具有良好的生物相容性，稳定的物理化学特性和可塑性，能通过改构实现药物装载和靶向递送，在疾病治疗方面有很好的应用前景[18]。研究[6]表明，由骨髓间充质干细胞、成骨细胞和破骨细胞分泌的外泌体可通过递送miRNA调节成骨细胞功能。此外，SONG等[19]研究发现小鼠微血管内皮细胞源外泌体具有良好的骨靶向性，并且miR-155能够通过外泌体作用于破骨细胞并抑制破骨细胞形成，从而抑制骨吸收。然而，在失重性骨质丢失的研究领域，尚未明确微血管内皮细胞能否通过外泌体来调节成骨细胞功能。miRNA是外泌体的重要组分，且外泌体的磷脂双分子层可保护miRNA分子免遭降解，从而更有利于miRNA进入靶细胞发挥调控作用[20-21]。miR-223-3p被认为是一种影响造血、免疫反应和炎症性疾病的骨髓特异性miRNA，参与NFκB、MAPK、PI3K/AKT、HIF-1α、NLRP3等多种信号通路[22]。最近研究表明，miR-223-3p通过靶向FOXO3抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化[11]。目前尚未有外泌体转运miR-223-3p调控成骨细胞分化的研究报道。

在本研究中，我们发现模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体可被MC3T3-E1细胞摄取，并增加MC3T3-E1细胞中miR-223-3p表达。分别向MC3T3-E1细胞中转染mimic-223-3p或inhibitor-223-3p进行功能实验发现，miR-223-3p能够抑制MC3T3-E1细胞分化。将电转mimic-NC或mimic-223-3p的Con Exos分别与MC3T3-E1细胞共培养，结果表明模拟失重下微血管内皮细胞可通过外泌体传递miR-223-3p抑制成骨细胞分化。此外，向Clino Exos电转inhibitor-223-3p抑制miR-223-3p可有效缓解模拟失重下微血管内皮细胞源外泌体对成骨细胞分化的抑制。综上所述，本研究首次阐明模拟失重下微血管内皮细胞可通过外泌体转运miR-223-3p抑制成骨细胞分化，这为防治失重性骨质丢失提供了一个潜在的干预靶点。但本研究尚未阐明外泌体转运miR-223-3p抑制成骨细胞分化的具体机制，未来将进一步开展相关研究。