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鸡蛋蛋壳生物矿化和力学特性调控的研究进展

2023-02-08齐广海

动物营养学报 2023年1期
关键词:乳突栅栏产蛋

齐广海 王 晶

(中国农业科学院饲料研究所,农业农村部动物产品质量安全饲料源性因子风险评估实验室(北京),农业农村部饲料生物技术重点实验室,北京 100081)

蛋壳是禽类进化过程中形成的一种保护自身繁衍的特殊结构,能够抵抗外力、防御微生物侵染和保障胚胎发育。蛋壳力学特性下降及各种缺陷问题的发生会给蛋鸡养殖业和鸡蛋加工业带来巨大的经济损失。蛋壳破损率占总产蛋量的8%~11%[1],在采集、包装、分级、运输等整条蛋生产链中甚至高达13%~20%[2-3]。蛋壳品质问题在产蛋后期更为突出,蛋壳强度急剧下降,缺陷发生频率剧增。产蛋后期的蛋壳破损率也是影响鸡群淘汰日龄的决定因素之一。此外,蛋壳屏障功能减弱或缺失极易造成微生物侵染,危及蛋品安全[4]。因此,产蛋后期蛋壳品质下降是保障蛋鸡产业健康发展和提升蛋鸡养殖效益亟待解决的产业瓶颈问题,也是蛋壳品质营养调控研究的难点和热点。本文综述了蛋壳的分级结构与生物矿化形成、力学特性下降以及调控方面的最新研究进展,旨在为通过营养干预措施改善鸡蛋蛋壳力学特性提供科学依据。

1 蛋壳的多级结构与生物矿化形成

1.1 蛋壳的多级结构

鸡蛋蛋壳是典型的以碳酸钙为矿化材料形成的生物矿化物。生物矿化物是具有多级尺度上的高度有序结构,每级结构都由更微观、有序的下一级结构组成。这种结构的分级组装解释了生物矿化物在力学性能上的复杂性和各向异性。宏观上,蛋壳由白色壳膜和钙化部分组成。在微观尺度(10~500 μm)上,蛋壳由内至外可分为未钙化的内和外2层蛋壳膜、钙化的不规则乳突层、中间的栅栏层、垂直晶体层和表面的胶护层(图1、图2-A)。其中,栅栏层厚度约占蛋壳总厚度的2/3,是蛋壳承受外力的主要受力层,由柱状的钙化晶体单元排列构成;乳突层是栅栏层形成的基础和蛋壳应力的微单元,乳突核成核位点的分布和形成决定了后续栅栏层碳酸钙晶体的取向和形状。在微米尺度(1~10 μm)上,内、外壳膜分别由直径1.5~2.5 μm和2.5~5.0 μm的纤维交织而成,并且内壳膜比外壳膜纤维的交联程度更为紧密[5](图2-B、图2-C);钙化部分是由不同形态的亚结构单元构成,亚结构单元主要由多孔性矿物与有机基质复合形成。例如,乳突层的亚结构单元是乳突体,由富含有机基质的基底部、钙储存体、帽部和冠状部等组成(图1)。在钙储存体中,碳酸钙以200~300 nm的亚微米小球存在,鸡胚发育时能够快速溶解,提供钙源。栅栏层的亚结构单元可看成是以有机基质为底板形成的多孔性矿化片层(图2-B),这些片层平行排列并通过纤维基质彼此相连[6]。在原子力显微镜下,可观察到钙化层各层是由直径10~100 nm的球形颗粒排列形成的纳米结构(图2-D、图2-E)。由乳突层到垂直晶体层,纳米颗粒逐渐变小,并且各层中纳米颗粒大小不一、变异较大[7]。

图1 蛋壳多级结构示意图Fig.1 Hierarchical structure of eggshell

图2 蛋壳扫描电子显微镜图(A、B和C)和原子力显微镜图(D和E)Fig.2 Scanning electron microscope images (A,B and C) and atomic force microscope images (D and E) of eggshell

蛋壳在微纳米尺度的有机与无机复合结构,使其在宏观上兼具了多孔、质轻、高强度等特点,这对蛋壳发挥抵抗外力破坏、保障胚胎发育的功能至关重要。例如,蛋壳中的孔隙同样包括3个层级:纳米颗粒之间直径小于10 nm的微孔;分布于垂直晶体层、栅栏层和乳突层的亚微米尺度的泡孔,直径约250 nm;贯穿钙化层的微米级气孔[5]。这种多层级的孔隙结构既保证了充分的气体交换,也增强了对外来物质侵染的防护。此外,蛋壳结构层中的孔隙并不是均匀分布。亚微米尺度上,孔隙率从垂直晶体层向栅栏层由外及内逐渐增加,在栅栏层的底部达到最大,随后由栅栏层向乳突层逐渐降低[8]。孔隙率的分布与结构层的力学特性变化是一致的,即从垂直晶体层、栅栏层到乳突层,弹性模量和硬度先降低后增加[7]。根据孔隙率分布和力学特性的变化,蛋壳钙化层更像是精心设计的“三明治”,可实现最大程度的气体交换并兼具最佳力学性能。

1.2 蛋壳的生物矿化形成

图3 蛋壳的生物矿化形成Fig.3 Biomineralization formation of eggshell

输卵管通过时序性分泌有机基质调控碳酸钙沉积速度、晶体大小、取向和生长,参与蛋壳的生物矿化形成。有机基质主要由蛋白质、糖蛋白和蛋白聚糖组成,占壳重的1%~3%。通过蛋白组学分析发现,矿化初期子宫液中含有大量直接参与矿化的蛋白;而调节蛋白活性的折叠蛋白、蛋白酶和蛋白酶抑制剂等驱动矿化的蛋白,主要在矿化初期和末期分泌;抗菌类蛋白在整个矿化中都分泌[15]。糖胺聚糖通过形成糖蛋白和蛋白聚糖发挥作用,广泛分布于蛋壳的各结构层。研究表明,蛋壳中具有功能的糖胺聚糖主要有4种,即透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和硫酸角质素。蛋壳壳膜中主要是透明质酸,蛋壳基质中以硫酸软骨素为主[16]。硫酸角质素蛋白聚糖参与形成乳突层的第1枚晶体的成核,硫酸皮肤素蛋白聚糖作用于钙化阶段,参与调解晶体的生长和定向[17]。透明质酸和硫酸皮肤素蛋白聚糖大量存在于蛋壳的栅栏层,构成蛋壳最厚的一层[18]。

2 蛋壳的力学特性及其影响因素

2.1 蛋壳的力学特性

蛋壳的力学特性是指其承受各种外加载荷时所表现出的力学特征。蛋壳力学特性的下降与破口、破壳、裂纹等缺陷的发生直接相关。蛋壳的破损包括裂纹的启动、扩展以及由此导致的壳体破裂。蛋壳强度是蛋壳力学特性最常用的评价指标,一般通过准静态压缩法测量蛋壳破裂时的最大负载。断裂强度的测量是将蛋壳作为一个整体评价其抵抗外力的能力,受壳体厚度影响较大。为了研究蛋壳微观结构特征对于裂纹扩展的影响,Bain[19]采用有限元分析法引入了断裂韧性这一指标。根据蛋壳在非破坏性载荷下的形变,Bain[19]还引入弹性模量这一材料力学指标,用于评价蛋壳产生弹性变形的难易程度或刚性。断裂韧性和弹性能够单独反映蛋壳结构和材料特性对力学性能的贡献。蛋壳的断裂韧性是由强度、厚度和赤道部半径计算所得,蛋壳弹性的计算综合考虑了蛋形指数、厚度、赤道部半径和硬度,具体计算公式及应用可参见Mabe等[20]和张亚男[21]的研究。由于实际生产中导致蛋壳破损的外力主要来自动态的撞击或挤压[22],Coucke等[23]提出了基于共振频率动态检测蛋壳力学特性的方法。这种无损检测方法能够实时分辨出壳体是否存在微裂纹,因此广泛用于鸡蛋的分级包装。通过建立模型,根据声学测试中敲击蛋壳时的振动曲线及蛋重,可计算得出蛋壳的动态刚度;动态刚度与静态载荷下测得的断裂强度反映了蛋壳的不同力学特性,二者同时应用能更好地评价蛋壳的力学特性[24]。

2.2 影响蛋壳力学特性的因素

蛋壳的力学特性受其材料属性和结构特征的共同影响。蛋的大小、蛋形和曲率、壳重及比例对力学特性的影响已有明确结论,不再赘述[25-26]。目前,关于蛋壳分级组装结构与力学性能的对应关系主要是在微观尺度上进行研究。超微结构中,栅栏层及晶体层是构成蛋壳强度和厚度的主要结构。而乳突层表征与蛋壳破损力直接相关。乳突层是蛋壳裂纹产生的初始位置。当蛋壳受到的外力超出承受范围时,乳突层和内、外壳膜互相牵制,发生变形;蛋壳的裂纹一旦产生,将沿着抗性最小的路径启动,在乳突成行排列的地方裂纹并迅速扩散,接着晶体层和栅栏层结构损毁,最终表现为蛋壳结构的坍塌与破裂;乳突单元的紧密连接和整齐排列可有效抑制裂纹扩散速度[27]。采用材料力学方法模拟因蛋壳微观结构变化导致的应力变化,结果表明,蛋壳微单元最大弯曲荷载与栅栏层厚度成正比,与乳突层厚度成反比,与乳突间距成反比[28]。这一结果表明,乳突层和栅栏层对蛋壳力学特性发挥着重要作用,即乳突层排列越紧密,栅栏层越厚,蛋壳应力越大;乳突层越厚,栅栏层越薄,蛋壳应力越小。在纳米尺度,发现栅栏层纳米颗粒的大小与晶体材料的硬度、弹性成反比,但在乳突层则相反[7]。

3 产蛋后期蛋壳力学特性的下降

3.1 蛋壳力学特性的周龄性下降

产蛋鸡周龄是影响蛋壳力学特性的重要因素。蛋壳强度和韧性通常在产蛋高峰达到最大值,然后随周龄增大而降低[29-31]。此外,蛋壳强度往往在产蛋后期和末期急剧下降。对海兰褐产蛋鸡30~80周龄蛋壳品质变化的跟踪表明,蛋壳强度和韧性直至50周龄出现显著下降,65~80周龄蛋壳强度显著低于之前各周龄,所能承受外力较31周龄降低20%以上[31]。因此,产蛋后期至末期蛋壳力学特性的变化具有明显的阶段性特点。与产蛋高峰期的蛋壳强度相比,产蛋后期至末期的蛋壳强度下降幅度高达8%~25%[30-34]。除了阶段性下降,还需关注蛋壳强度的群体变异性。无论是在产蛋高峰还是产蛋后期鸡群中,蛋壳强度的变异系数均超过10%[30-31]。随着产蛋鸡周龄增大,低强度蛋壳占比增加,31周龄时蛋壳强度低于35 N的鸡蛋占比仅为5%(平均值为48.60 N),80周龄时则高达50%左右(平均值为35.28 N)[35]。

3.2 蛋壳力学特性下降的原因

随着产蛋鸡周龄增大,鸡蛋重量、蛋形和蛋壳面积递增,这是导致产蛋后期蛋壳力学特性下降及破损率增加的主要原因。蛋形变大而碳酸钙的沉积并未同步增长,导致单位面积蛋壳重量降低。在整个产蛋周期中,鸡蛋长径与蛋壳强度间呈显著负相关[30]。对海兰褐31~80周龄蛋鸡蛋壳品质的跟踪测定表明,每枚鸡蛋蛋壳总钙含量没有显著变化,说明整体上蛋壳钙沉积总量比较稳定,但是蛋壳钙百分含量和单位蛋壳面积钙含量随周龄增大而下降[31],加剧了产蛋末期(70~80周龄)蛋壳力学特性的降低。产蛋后期蛋壳结构中气孔和基质增多,进而导致蛋壳致密性下降[36]。而蛋壳厚度、蛋壳绝对质量及相对比例的变化与蛋壳强度的周龄性下降并不同步[31]。在海兰褐(21~70周龄)、罗曼(36~76周龄)、伊莎褐(22~72周龄)和我国雪山草地鸡中,蛋壳强度随周龄下降的同时,蛋壳厚度并无规律性变化[29,37-38]。有研究指出,鸡蛋物理参数(长径、短径和蛋壳厚度)仅能解释蛋壳强度变异的56%[39];蛋壳绝对质量及相对比例的变化不能完全解释产蛋高峰期至后期蛋壳力学特性下降的成因[34-35]。

蛋壳微观结构的变化参与了后期力学特性的下降。一是蛋壳乳突层比例随产蛋鸡周龄逐渐增加,并与蛋壳强度的变化显著相关,而钙化层或有效层比例相应降低[31]。比较相同蛋厚度的产蛋高峰期(42周龄)和后期(72周龄)的蛋壳结构,发现后期蛋壳乳突层厚度及比例显著增加,有效层厚度及比例降低,蛋壳强度降低[40]。二是产蛋后(末)期B型乳突体、晚期融合等乳突结构异常变化的发生加剧了蛋壳力学特性的下降[31,40]。与产蛋高峰期(25~40周龄)蛋壳相比,产蛋中期(40~55周龄)、后期(55~65周龄)和末期(>65周龄)蛋壳超微结构乳突层中,乳突体变大,晚期融合发生率升高,袖口状结构发生率降低[41]。随产蛋鸡周龄增大,乳突体晚期融合的发生明显增加,这种变化在多个蛋鸡品系普遍存在[27,32,42]。乳突体融合发生越晚,表明在蛋壳形成过程中栅栏层的生长更晚,栅栏层厚度降低,会大大降低蛋壳对外力的承压能力[27,43];此外,晚期融合的发生表明乳突层间的连接较弱。当蛋壳受到外力作用,乳突晚期融合位点极易发生应力集中,引发静载断裂,直接表现为蛋壳断裂韧性下降;乳突体的晚期融合可能是由于B型乳突体在相邻乳突体间形成的空间阻隔引起的[27]。

造成蛋壳力学特性下降的生理因素主要有老龄产蛋鸡肠道钙吸收能力下降、维生素D代谢障碍、雌激素水平降低及其受体表达失衡、子宫组织功能紊乱等。与产蛋高峰期相比,产蛋后期蛋鸡十二指肠的钙吸收能力下降[44],参与维生素D3代谢的肾脏1-α羟化酶活性降低[45],血液中1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)2D3]水平降低[45-46],参与血磷调节的髓质骨成纤维细胞生长因子23(FGF23)基因表达显著提高[46],提示产蛋后期蛋鸡钙磷代谢稳态失衡。此外,随产蛋鸡周龄增大,蛋壳强度降低,同时可见子宫内膜纤维化、萎缩及微绒毛消失等病理性变化[47],雌激素受体α含量及其与受体β比例失衡[48]。有研究指出,产蛋后期蛋鸡子宫免疫调节功能降低和基质蛋白合成紊乱,是蛋壳超微结构异常和力学特性下降的重要原因之一[40]。

4 蛋壳力学特性的营养调控

越来越多的研究表明,通过调节产蛋鸡钙磷代谢、补充微量元素和维生素以及使用植物提取物、精油、有机酸、益生菌等添加剂,都能在一定程度上改善蛋壳的力学特性,对其添加水平、作用效果和相关机理已有很多总结[49-52]。根据蛋壳的分级结构和矿化过程,缓解蛋壳力学特性下降可采取2种思路:一是基于蛋壳的化学组成,增加蛋壳钙沉积;二是基于蛋壳结构及动态矿化过程进行调控。

4.1 基于蛋壳组成的调控

通过调节蛋鸡钙磷代谢增加蛋壳钙的沉积,这是目前研究和应用最为广泛的调控措施,包括调节钙源及水平、选择石粉粒度、调整磷水平和添加植酸酶、补充维生素D3及其代谢产物,这些措施对于解决产蛋鸡钙摄入量不足或钙吸收利用受阻及其导致的蛋壳厚度和力学特性下降,在一定前提下可能有效。例如,增加石粉粒度可延长其在前消化道中停留时间、提高溶解度,通过在夜间持续提供更多的可溶性钙,减少骨钙动员。对多个研究的综合分析表明,石粉粒度由0.15 mm增加至1.50 mm,蛋壳比重增加0.8%,蛋壳厚度增加1.1%,蛋壳强度增加3.0%[53]。因此,在产蛋后期推荐采用60%~65%的粗颗粒(2~4 mm)石粉。实际生产中常出现由于饲料分级造成的蛋鸡钙、磷、维生素D等摄入差异较大。饲粮摄入的维生素D3在肝脏和肾脏中分别经25-羟化酶和1α-羟化酶作用下形成1,25-(OH)2D3。1,25-(OH)2D3可促进肠上皮细胞钙结合蛋白的表达,增加钙吸收。子宫部钙转运蛋白的基因表达依赖于机体钙水平,产蛋后期产薄壳蛋的鸡只具有明显的维生素D代谢缺陷[54]。因此,产蛋后期补充维生素D3或25-羟基维生素D3(25-OH-D3)可提高蛋鸡钙的表观消化率,改善蛋壳强度[55-56]。

需要注意的是,仅仅通过提高饲粮钙水平或补充维生素D3增加钙的供给,对解决后期蛋壳破损或力学特性下降具有局限性。增加蛋壳钙的沉积至少需要考虑肠道对钙的吸收、髓质骨钙的动员以及子宫部对钙的转运和利用。高钙饲粮(4.5%)可能引起子宫部钙转运的紊乱,导致蛋壳钙的异常沉积[56-57]。将60周龄蛋鸡饲粮钙水平从3.5%提高至4.0%,对蛋壳强度和厚度没有显著影响[58]。逐步提高饲粮钙水平(3.5%、4.5%、5.5%)也未能有效解决产蛋后期的蛋壳破损问题[59]。另外,维生素D3及25-OH-D3的作用效果容易受到饲粮钙、磷水平的影响,提高饲粮维生素D3水平并不能完全补偿钙、磷的缺乏,高剂量钙反而造成子宫部蛋壳钙沉积的紊乱。长期饲喂高剂量维生素D3(5 520 IU/kg)或补充25-OH-D3(2 760 IU/kg)也未观察到对产蛋后期蛋壳品质的改善作用[60]。补充维生素D3(在2 200 IU/kg的基础上补充0~88 000 IU/kg)提高血清钙水平,但也加重了蛋壳的丘疹缺陷[61]。

关于益生菌对蛋壳钙沉积和力学特性影响的报道不尽一致,主要原因可能也是仅考虑了肠道的钙吸收环节,忽略了子宫组织对钙的利用和矿化过程的调控。有研究报道,饲喂单一益生菌制剂或复合益生菌制剂显著提高了蛋重和蛋壳厚度[62],并降低了产蛋后期的蛋壳破损率[63];或给予益生元(低聚糖)和合生元(菊粉+枯草芽孢杆菌)后,蛋壳密度、强度、厚度显著增加[64]。此外,也有研究报道,饲粮添加益生菌或玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)对蛋壳品质无显著改善作用[65-66]。由此可见,关于益生菌对蛋壳的作用机理,可能仅限于通过降低肠道pH或代谢产物(如短链脂肪酸等)提高钙的溶解度,或通过增加肠黏膜面积及完整性促进肠道钙的吸收。

4.2 基于蛋壳结构及动态矿化的调控

微量元素锰、锌不仅是蛋壳的无机组分,也作为辅酶因子参与超微结构形成,这为营养调控结构和力学特性提供了可行性。本实验室多年的系列研究表明,饲粮锰调控蛋壳结构的动态形成,乳突形成时期和快速矿化期是其发挥作用的关键时期[67]。锰参与乳突形成时期子宫近端蛋白糖基化和聚糖代谢,通过提高蛋白聚糖和糖蛋白表达调控乳突形成和密度,提高了蛋壳矿化初期的乳突密度,降低快速矿化期乳突宽度和厚度,从而提高有效层厚度和蛋壳力学特性[68-71]。饲粮锌通过上调子宫部碳酸酐酶表达和活性,以及骨桥蛋白和卵功能蛋白-116的基因表达,增加了蛋壳碳酸钙沉积和晶体致密性,减少了表面裂纹。因此,微量元素的缺乏或不足可导致蛋壳结构异常和力学特性下降[72]。针对不同微量元素改善蛋壳品质的效果,研究表明,有机锰(复合氨基酸锰)相对于无机锰(硫酸锰)的生物学效价分别是406%(蛋壳强度)、458%(蛋壳弹性)和357%(蛋壳厚度)[69],有机形式锰和锌的推荐剂量是40~60 mg/kg[70]、40 mg/kg[72]。还有研究进一步优化了锰、锌、铜、铁的联合添加模式[73]。

实际上,蛋壳结构形成和蛋壳钙的沉积是在矿化过程中同时发生。在改善蛋壳结构的同时,也观察到蛋壳钙沉积的增加。例如,枯草芽孢杆菌制剂具有促进钙吸收和调控蛋壳超微结构的双重作用。一方面,枯草芽孢杆菌能够改善十二指肠肠道形态,增加钙结合蛋白基因表达量及提高钙的表观代谢率;另一方面,枯草芽孢杆菌降低了蛋壳的乳突厚度与宽度,提高了乳突数量、有效层厚度和蛋壳总厚度[74]。在饲粮钙充足(钙水平3.5%~4.5%)时,枯草芽孢杆菌通过优化超微结构组成,进一步提高了蛋壳力学特性[75]。与此类似,植物提取物和精油能够改善子宫部矿化环境,从而降低蛋壳超微结构异常的发生,同时促进钙转运和壳钙的沉积;产蛋后期饲粮添加混合精油通过改善子宫炎性免疫状态,调节离子转运和基质蛋白基因的表达,减少了蛋壳乳突层异常结构的发生频率,并增加了蛋壳整体及有效层厚度,改善了蛋壳力学特性[76]。此外,饲粮钠可提高蛋壳膜中硫酸化糖胺聚糖和糖醛酸含量,降低乳突层厚度和乳突体宽度,增加蛋壳有效层厚度和钙含量,提高蛋壳强度[77-78];而硫酸钠可进一步提高蛋壳钙化层的硫酸化糖胺聚糖含量和有效层厚度,改善效果优于碳酸氢钠[79]。

基于蛋壳矿化形成的时序性,尤其是血液钙、磷及相关激素在产蛋过程中的动态变化[80],有研究提出,通过动态饲喂(dynamic feeding)或分饲(split feeding)等差异化营养供给措施,匹配蛋鸡在夜间对钙更高的需求,提高蛋壳钙的沉积和力学特性。采用上午低钙和下午高钙饲喂方式,可影响肠道昼夜节律、钙转运和抗氧化基因的表达[81];提高蛋鸡对总钙的摄入量,但未观察到对蛋壳品质的改善作用[82-83]。在限定相同采食量和钙摄入量时,采用上午低钙和下午高钙饲喂方式,提高了钙的吸收和沉积,蛋壳强度在数值上有所提高但未达到显著水平[84]。由于鸡上午和下午的耗料量比例大约是2∶3[82];当按照鸡的采食行为将上午和下午饲喂量比例由1∶1调整为1∶2,且饲粮钙水平由3.5%降低为3.0%,未见蛋壳质量下降,说明该饲喂方式提高了钙的利用率[85]。这种营养差异化供给方式对产蛋后期蛋壳力学特性的改善效果尚需进一步验证。

5 小结与展望

蛋壳的力学特性与破损率直接相关,是蛋鸡生产中重要的经济性状。如何缓解或有效解决产蛋后期的蛋壳品质下降,也是实现蛋鸡生产“产蛋期延长计划”(不强制换羽100周龄产500枚蛋)亟待解决的瓶颈问题。蛋壳分级结构及其生物矿化形成机制的研究可望为解析力学特性下降、研发调控措施打开新的视角。目前蛋壳结构的变化还只是作为营养调控试验的观察指标或作用方式,尚未提出针对性的调控措施。作为高度有序结构的生物矿化物,蛋壳的宏观性质来自于每个层次对各级性质的贡献,其各级结构特征及尺寸分布、组装调控方式有待进一步研究,以阐明局部矿化环境中碳酸钙晶体异常沉积导致结构变化的机理。针对蛋壳力学特性和矿化特点,通过细分阶段研发精准营养调控措施,开展长周期的组合调控和综合评估,建立改善蛋壳力学特性的全产蛋期矿化调控技术,将为改善蛋壳力学特性提供有力支撑。此外,良好的蛋壳品质是产蛋鸡健康的综合表现。蛋壳的形成主要发生在输卵管,但并不局限于输卵管,肠道、骨骼、肝脏、肾脏等多个器官均参与蛋壳矿化的调节。保障肠道钙吸收、平衡骨重吸收和钙供给、改善输卵管矿化微环境等也是调控蛋壳力学特性中的关键环节。

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