基于主要成分分析不同大米肽的品质与综合评价

胡武瑶，黄晶，黄莹，赵彤，陈曦，杨晓*

中国健康促进基金会抗衰老营养与健康研发中心（武汉 430000）

大米肽主要含有肽混合物及少量的游离氨基酸、水分、糖分和无机盐[1]*，具有低敏性[2]*、易消化吸收[3]*以及生物学效应[4]*的特点。大米肽的氨基酸构成模式与人体的需求模式基本一致[5]*，能够为人体提供所需的各种氨基酸和肽营养。大米肽还具有调节机体生理活动的保健功能，如降血脂[3]*、降胆固醇[4-5]*、降血压[6]*、抗氧化[7]*、增强肌肉[8]*等作用。大米肽已被国家卫生健康委员会批准为具有免疫功能的食品，且已被作为功能性成分添加到保健食品中。

随着对大米肽功能的深入研究，大米肽在食品中的应用也逐渐广泛，它可以改变食品的品质、风味，也能增强食品的功能性[9]*，由于目前缺乏大米肽的国家或者行业标准，导致市面上大米肽的品质参差不齐。大米肽的品质决定其营养特性和功能特性[10]*，因此此次研究采用高效凝胶色谱法和氨基酸分析仪等技术，以大米肽的蛋白质含量、肽含量、分子量分布和氨基酸分析作为品质评价指标，并结合主成分分析对23种不同大米肽进行品质综合评价，以期为市场上大米肽的品质鉴定提供理论依据，为大米肽生产企业和大米肽产品提供产品标准的理论依据，有利于促进大米肽行业的技术水平和市场的迅速发展。

1 材料与方法

1.1 主要设备与试剂

S-433Dup全自动氨基酸分析仪[赛卡姆（北京）科学仪器有限公司]；MTN-2800D-12氮吹仪（天津奥特塞恩斯仪器有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱（配有GPC数据处理软件，美国Agilent公司）；TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；K1100全自动凯式定氮仪（海能未来技术集团股份有限公司）；JRX-10S曲线升温消化炉（济南精锐分析仪器有限公司）；202-2AB电热恒温干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；AB204-A分析天平（上海梅特勒-托利多仪器公司）。

钠缓冲液A-1、钠缓冲液B-1、钠样品稀释液、17种氨基酸混合标样、钾钠缓冲液、钠再生液、茚三酮[赛卡姆（北京）科学仪器有限公司]；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、三氯乙酸（色谱纯）、胰岛素、杆菌肽、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（上海安谱科学仪器有限公司）；浓盐酸、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）；23种大米肽采购自23家不同的生物科技公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蛋白质含量测定

参考GB 5009.5—2016[11]*中第一法凯氏定氮法测定蛋白质含量。

1.2.2 肽含量测定

准确称取1.00 g样品，加入15%三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容至50 mL，混匀静置5 min，过滤去除初滤液，滤液作为备用液。然后测定滤液中的蛋白质含量，测得的结果即为酸溶蛋白的含量。

称取30.00 mg的大米肽粉，用稀释液定容至10 mL，然后离心取上清液，用0.22 μm滤膜过滤后用氨基酸自动分析仪以外标法测定大米肽样品中的游离氨基酸，肽含量按式（1）计算。

1.2.3 相对分子量分布测定

本次临床试验，共发现不良事件19例，其中试验组9例（7.63%），对照组10例（8.33%），两组比较，差异无统计学意义。经研究者判定为不良反应7例，其中试验组4例（3.39%），对照组3例（2.50%），均表现为皮肤刺激症状，两组比较，差异也无统计学意义。两组生命体征及实验室检查，未发现有临床意义的异常改变。

采用高效凝胶色谱法（High performance gel chromatography，HPGFC）测定大米肽样品的分子量分布。

标准曲线制作：用流动相配制质量浓度为1 mg/mL的不同相对分子质量的胰岛素、杆菌肽、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸的肽标准品溶液，按一定比例混匀后，用0.22 μm有机滤膜过滤后进样，即可得到标准品色谱图，以相对分子质量的对数对保留时间作线性回归方程。

样品处理：准确称取10.00 mg大米肽样品于10 mL容量瓶种，用流动相定容，过0.22 μm有机滤膜过滤，滤液即为待测样品。

色谱条件：色谱柱 TSK-GELG 2000swxL300 mm×7.8 mm；流动相：V乙腈+V水+V三氯乙酸=20+80+0.1；检测波长：220 nm；流速：0.5 mL/min；检测时间：30 min；进样体积：20 μL；柱温：室温。

1.2.4 氨基酸组成和含量测定

称取80.00 mg大米肽样品于水解管中，加10 mL 6 mol/L的HCl（含0.2%苯酚），吹氮气3～5 min后拧紧瓶盖，放入110 ℃烘箱中水解22 h，冷却至室温，将水解液转移至25 mL容量瓶中，用超纯水定容并过滤。取0.5 mL滤液至蒸发皿中，在60 ℃烘箱中蒸干，蒸干后加0.5 mL超纯水，蒸干，再加0.5 mL超纯水，蒸干。加入3 mL样品稀释液，待完全溶解后用0.22 μm滤膜过滤，取0.3 mL滤液加0.6 mL样品稀释液，用氨基酸自动分析仪以外标法测定大米肽样品中的氨基酸组成和含量。

1.2.5 综合评价方法

1.2.6 统计分析

采用Excel 2010和SPSS 19.0软件进行数据处理与主成分分析。

2 结果与讨论

2.1 23种大米肽的蛋白质含量分析

23种大米肽的蛋白质含量结果见表1。从表1可以看出：蛋白质含量≥90%的样品占26.1%；85%≤蛋白含量＜90%的样品占56.5%；80%≤蛋白含量＜85%的样品占17.4.0%。这说明大米肽的蛋白含量较高，是很好的蛋白质来源。23种大米肽的蛋白含量各不相同，这可能是因为其原料来源和工艺差异造成的[12]*。

表1 23种大米肽的蛋白质含量测定结果

蛋白质含量的高低是衡量以蛋白为主要成分的产品品质的重要指标之一。由于目前缺乏大米肽的国标，参考GB/T 22492—2008《大豆肽粉》[13]*按蛋白含量进行质量分级，蛋白含量≥90%为一级，85%≤蛋白含量＜90%为二级，80%≤蛋白含量＜85%为三级。23种大米肽中有26.1%可分为一级，有56.5%可分为二级，有17.4%可分为三级，这说明以蛋白质含量作为评价标准之一时，23种大米肽的质量主要集中在二级。

2.2 23种大米肽的肽含量分析

23种大米肽的肽含量结果如表2所示。结合表1和表2的结果可知，酸溶蛋白含量占总蛋白含量的90%以上样品占比73.9%，这说明大米肽样品中小分子量的肽是其主要组成部分，是因为高分子量蛋白质在酸性条件下易被沉淀，较低分子量的蛋白质水解物即酸溶蛋白易溶于酸性溶液[14]*。从表2的游离氨基酸结果可以看出，游离氨基酸含量≥5%的样品占39.1%，游离氨基酸含量＜5%的样品占60.9%。大米肽提取过程本质是大米蛋白经酶解的过程。当酶解程度不够时，水解产物的分子量大，产率低；当水解过度时，会产生大量游离氨基酸，难以得到所需分子量范围的大米肽产品[15]*，但由于无论如何控制酶水解过程，均会产生一定量的游离氨基酸，所以游离氨基酸含量的指标也可作为衡量大米肽品质的重要参数。

肽含量是评价大米肽品质的关键指标之一，因为大米肽的生物活性主要由肽体现，肽含量越高，大米肽纯度越高。从表2的肽含量结果可以看出，23种大米肽样品的肽含量≥80%和肽含量≤70%均仅占17.4%，而70%＜肽含量＜80%的样品占82.6%，这说明23种大米肽的肽含量主要集中在70%～80%范围内，且23种大米肽的肽含量均不相同，这可能是因为其水解时所选择的酶和酶解条件不同所致，酶作为一种具有专一性的特殊蛋白质，其活化中心不同，水解得到的肽片段也将不同，所以水解得到的肽含量也会存在一定的差异[16]*。

表2 23种大米肽的肽含量测定结果

2.3 23种大米肽的分子量分布分析

分子量的大小直接决定了大米肽可被人体吸收利用的效率[17]*，决定着大米肽的营养价值。研究表明，肽段的分子量越小越容易被人体吸收，其生物活性可能越高[18]*，所以分子量分布也是评估大米肽产品品质的关键指标之一。23种大米肽的分子量分布的结果如表3所示。23种大米肽的分子量主要集中在2 700 Da以下，且分子量分布主要集中在630～189 Da和1 200～630 Da这两个区间范围内，占比分别为33.48%～66.73%和14.29%～26.97%，这说明23种大米肽中小分子肽是其主要组成部分，这与2.2小节中酸溶蛋白结果一致，与王申等[19]*的研究结果相似。23种大米肽的分子量分布均不同，这可能是因为大米肽提取时所用酶不同，而不同酶的酶解位点不同，即使同一大米蛋白在不同蛋白酶的作用下，也会产生不同分子量大小的肽片段。

表3 23种大米肽的分子量分布测定结果 单位：%

接表3

2.4 23种大米肽的氨基酸分析

氨基酸成分分析是研究各种肽类物质构造、特性和营养价值的重要手段[20]*。大米肽的生物活性与其氨基酸组成和含量紧密相关，对23种大米肽进行氨基酸分析，氨基酸组成和含量测定结果见表4，由于采用酸水解法，色氨酸被破坏，故表4中无色氨酸。

从表4可以看出，23种大米肽的氨基酸含量丰富，富含人体所必需氨基酸，且氨基酸组成和含量均不相同。23种大米肽的总氨基酸（TAA）含量在78.31%～100.40%范围内，必需氨基酸（EAA）的含量在16.31%～32.16%范围内，EAA占TAA的18.15%～34.46%；疏水氨基酸（HAA）含量在27.34%～59.57%范围内，HAA占TAA的33.22%～59.33%；支链氨基酸（BCAA）的含量在6.96%～17.54%。有研究表明疏水氨基酸与肽的抗氧化活性存在一定的相关性[21]*，疏水性氨基酸含量越高，抗氧化能力越强[22]*。BCAA可通过雷帕霉素机械靶蛋白（mTOR）途径刺激肌肉合成代谢、抑制运动诱导的肌肉蛋白分解，并在组织生长和修复中其重要作用[23]*。

表4 23种大米肽的水解氨基酸分析 单位：%

23种大米肽均含有较高的谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp），其次是精氨酸（Arg）、亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala），这与周侃等[24]*的研究结果相似。Glu在生物体内的蛋白质代谢过程种占据重要地位，是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一[25]*。Asp是一种良好的营养补充剂，可以用于治疗心脏病、肝脏病和高血压症，具有防止和恢复疲劳的作用[26]*。Leu具有螯合金属离子的作用，可通过降低金属离子的氧化还原电势来稳定金属离子的氧化态，从而减少金属离子的催化氧化，达到抗氧化的作用[27]*。研究报道，Arg、Leu、Ala、缬氨酸（Vla）、酪氨酸（Tyr）等与肽的抗氧化活性有关[28]*。

接表4

2.5 23种大米肽的品质综合评价

表5中显示了主成分方差贡献率，表6显示了主成分载荷矩阵。从表5可以看出，主成分1和主成分2的累计贡献率为82.631%，说明两个主成分可基本代表最初变量的所有信息。从表6可以看出，对第1主成分正向影响较大的为肽含量、酸溶蛋白含量和HAA/TAA含量，载荷数分别为0.971，0.942和0.914。以各个指标的载荷权数和主成分特征值，计算各指标的特征向量。用特征向量为权重，得出主成分得分Z的计算公式：

表5 主成分方差贡献率

表6 品质指标的主成分载荷矩阵

式中：Z1、Z2分别是第1和第2主成分得分；X1～X7分别为大米肽的蛋白、酸溶蛋白量、游离氨基酸、肽、分子量分布在1 200～189肽段、EAA/TAA和HAA/TAA含量。以各主成分对应的方差贡献率作为权重，由主成分得分和对应的权重线性加权求和，得到品质综合评价模型F，如式（4）所示。

根据模型计算出23种大米肽品质的综合评价值并进行排序，结果见表7。从表7可以看出，样16、样18和样4是综合评价排名前3的大米肽样品。

表7 23种大米肽的主成分得分与排序

3 结论

随着大米肽的功能性被逐渐发掘，市面上也出现了越来越多的大米肽产品，但是大米肽的品质参次不齐，难以判别其品质优劣。此次研究以23种大米肽的蛋白质含量、肽含量、分子量分布、氨基酸分析作为品质评价指标，采用主成分分析法建立了不同大米肽品质综合评价模型。结果显示：23种大米肽的蛋白含量均大于80%，且56.5%的大米肽的蛋白含量在85%～90%的范围内；有86.2%大米肽的肽含量在70%～80%范围内，其分子量均主要集中在2 700 Da以下，且分子量在630～189 Da为其主要组成部分占大米肽的33.48%～66.73%；均含有人体必需氨基酸，Glu和Asp是大米肽中含量较高的氨基酸；采用主成分分析对23种大米肽样品进行品质综合评价，结果显示样16、样18和样4是综合评价靠前的大米肽样品。目前由于缺乏对大米肽提取原料的分析对比研究，酶解技术尚不成熟以及缺乏生产标准体系的参考，导致各企业所生产的大米肽品质良莠不齐，从而限制了大米肽进一步市场化，影响了大米肽在普通食品、保健食品、烘焙食品以及婴幼儿食品等中的应用。此次研究通过对23种大米肽的品质分析与综合评价，对大米肽工业化生产过程中的品质控制具有一定的参考价值，从而促进大米肽行业技术水平的提升，有利于大米肽产业的发展。