双水相分离技术应用于蛋白质纯化的研究进展

赵悦彤，尤一，马小来，段小群*

桂林医学院药学院（桂林 541000）

双水相分离技术，是利用聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性造成的两水相间物质分配系数差异，而实现的分离技术。因其操作简单、价格低廉、无污染、易放大等优势，已被广泛被应用于各种生物物质分离应用中。不同双水相体系组成可以分离许多不同物质，因材料科学和液体处理等方面的最新研究进展，可以给研究人员提供更多思路。基于此，对双水相体系的历史和成相原理及在蛋白纯化工艺中的应用进行概述。

1 介绍

当2种不相容的聚合物、1种聚合物和1种盐在水基溶剂中超过阈值浓度导致液-液分离时，形成双水相系统（ATPS），这一现象早在1896年就由荷兰微生物学家马提努斯·拜耶林克发现。20世纪50年代，人们开始利用ATPS分离生物物质，因各种物质在ATPS各区域（上相、下相、界面）的分配存在不同优先性，可利用这一原则分离蛋白质、病毒、细胞和细胞碎片[2]*。

双水相的优势在于蛋白在双水相体系中不会失活或变性，因为其水分占大比例且分离过程温和，尤其适合用于热敏蛋白。同时做到分离、纯化两步骤一步完成。设备要求低，操作简单易于放大，可实现工业连续自动操作。但双水相分离效率不高且易乳化。相组成中的盐类如硫酸铵含量过高会导致蛋白析出，影响后续分离。分离后的蛋白质溶液含有高分子聚合物和盐类，需将其去除。

2 双水相分离技术应用

ATPS被广泛应用于分离科学领域，除了分离纯化蛋白[3]*外，还可用于分离和回收抗体[4]*、病毒样颗粒[5]*、抗生素[6]*、DNA[7]*、细胞、胞外小泡[8]*和激素[9]*。ATPS在微流体[10]*、细胞工程、生物打印和环境保护的应用方面使用率也逐渐增多。

2.1 传统双水相系统

传统的液-液萃取技术通常不适用于酶的纯化，因为有机物的存在会造成酶活性损失[11]*。超滤技术和硫酸铵沉淀技术用于蛋白质纯化的效率比较低，而另一些蛋白纯化技术则程序复杂而收率偏低[12]*，例如亲和色谱、离子交换色谱、疏水色谱柱都是步骤繁琐、成本昂贵和低收率的纯化技术。而ATPS技术用于蛋白质纯化则廉价而易操作[13]*，也不会导致蛋白质失活。

Ramakrishnan等[14]*采用传统的聚合物-盐（PEG/磷酸盐）ATPS从乳酸细菌屎肠球菌中提取细胞内脂肪酶，结合超滤后活性回收率为82.09%，纯化系数为5.99%。王莹等[15]*采用PEG4000/硫酸铵双水相体系分离萃取香菇柄水提液中的多糖与蛋白质，结果显示，在最佳提取条件下，蛋白质萃取率达81.57%。另外Saravana等[16]*使用单步聚乙二醇/柠檬酸三钠两相系统中从南美白乳杆菌废物中提取和纯化增殖蛋白。在最佳条件下，最大分配系数和蛋白质收率分别为2.79%和92.37%。

2.2 亲和双水相系统

亲和双水相是在双水相中引入亲和配基利用亲和配基与目标产物之间的特异性亲和作用，有效改善目标产物在双水相中的选择性分配，从而大幅提高分离过程的效率和分离产品纯度的提取方法[17]*。

蒋志国等[18]*利用金属螯合双水相亲和分配技术萃取木瓜蛋白酶。在PEG/PEG-IDA-Cu2+*/Na2SO4双水相体系中，最优条件下木瓜蛋白酶的酶活性回收率可达90%左右，蛋白分配比达5.11。Liu等[19]*构建一种由混合胶束组成的新型亲和力ATPMS，结果表明基于亲和力的HM-EO/TX-Cu（II）体系具有较高的分配性能，有望有效分离组氨酸标记的蛋白质。

2.3 离子液体双水相系统

2002年Dupont等[20]*在合成离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（[C4mim][BF4]）时发现KCl和（[C4mim][BF4]）之间存在盐析效应，有学者对这种盐析效应做了进一步研究，并提出“离子液体双水相”这一新概念，由此开始离子液体双水相体系的研究。离子液体双水相是基于高聚物双水相发展而来的一种高效温和萃取分离体系，用亲水性的离子液体（ILs）与无机盐的水溶液进行混合，形成互不相溶的两相。离子液体可以替代一些有毒挥发性有机化合物且阴阳离子之间的可调节性、良好的热稳定和化学稳定性使得离子液体双水相得到更多的应用[21-22]*。

施娅楠等[23]*采用[C4mim]Br/K2HPO4双水相抽提技术从辣木叶蛋白中分离凝乳酶，最佳萃取条件下木叶凝乳酶的酶活性回收率达85.5%，纯化因子达1.49。与已报道用的盐析法相比分离效果好且步骤简单，降低酶活性损失。李梦瑶等[24]*基于[C4mim]Cl/K2HPO4双水相体系，萃取分离番茄中5种抗氧化酶（CAT、POD、SOD、AAO、PPO）。建立的新方法比已报道的采用缓冲溶法提取的5种抗氧化酶活性高、稳定性好，且萃取时间由原来的30 min缩短至20 min。

2.4 双水相逆流色谱

固体分离介质可能引起酶不可逆吸附、失活和变性等问题。双水相体系逆流色谱技术结合逆流色谱的快速高效、制备量大及双水相体系简单温和、无污染的特点避免这些问题的发生，因此在蛋白质的分离方面有很好的应用潜力[25]*。

Wade等[26]*使用高浓度磷酸钾和聚乙二醇双相水性两相系统联用逆流色谱（CCC）装置，直接在ATPS中提取初始粗植物提取物并只在下相注入使之能高度选择性地分配黑芥子酶复合体，然后在螺旋圆盘CCC上进行短层析。最佳结果和从其他植物蛋白中分离出的黑芥子酶相比纯化倍数提高60倍。

2.5 双水相与其他方法的联用

双水相又可以与其他方法联用达到更好的纯化效果和工作效率，如超声辅助双水相[27]*、超声高效、节能常用于生物活性物质提取[28]*。超声波有富集效应，可缩短有机相和水相的相分离时间，且随超声时间增加温度升高可以提高物质溶解度。微波辅助双水相法的优势是微波可以穿透式加热，利用热效应促进蛋白溶出，缩短提取时间，有研究显示使用微波辅助双水相应用于提取酚类[29]*、多糖等，也能应用于蛋白的纯化工作。超声辅助离子液体双水相法则利用了离子液体良好的溶解能力和稳定性高等优点。反萃取后的离子液体水溶液还可以作为提取溶剂循环使用，降低成本[30]*。

3 结语与展望

ATPS已实现简单、经济高效的目标。利用形成ATPS的聚合物的低界面张力、分配效应和高度的生物相容性等特性来达到分离目的。温和易放大的优势使更多人使用这种纯化方法，不过影响成相的因素也有很多，如pH、温度、聚合物或盐浓度、目的蛋白特性等会给实验探索造成困难。不过双水相带来的优势远超于其劣势。双水相还被用于金属离子分离、环境修复、冶金应用等方面，希望日后双水相的更多特性可以被探索，以便研究人员应用于新的领域。