提高酿酒酵母耐受性能的研究进展

马吉喆，李镕涛，陆筑凤，李加友*，徐涛*

1. 浙江理工大学生命科学与医药学院（杭州 310018）；2. 嘉兴学院生物与化学工程学院（嘉兴 314001）

乙醇（酒精）是重要的大宗化学品，在化学工业、医药卫生、食品和农业等方面都有非常广泛的用途。2020年全球利用酵母发酵生产的乙醇达990亿 L，其中美国的产量占54%，巴西占30%[1]*，而我国的产量为92亿 L，约占10%。面对复杂多变的国际局势造成的能源危机和使用化石燃料带来的严重环境问题，作为最具潜力的可再生能源生产方式，利用淀粉和木质纤维为原料发酵生产乙醇的技术研究深受学术界和产业界的关注，燃料乙醇是可再生能源中替代石油的最优选择[2]*。

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是发酵生产燃料乙醇的最重要微生物，因为酿酒酵母的生长速度快，对糖的转化利用率高，并且人类对其开发利用的历史悠久，对其生物学特性已有充分了解[3-5]*。但是，酿酒酵母对高体积分数乙醇较为敏感，工业化的发酵体系中乙醇体积分数通常不能超过14%，被认为是燃料乙醇生产成本过高的最主要原因，这严重制约了燃料乙醇的商业化发展[6-8]*。

深入研究酿酒酵母对乙醇等胁迫条件的耐受机理，建立高效的应对措施是学术界和产业界共同关注的课题。基于此，对近年来在酿酒酵母的乙醇耐受、高温耐受和高渗耐受机制研究进行总结，并综合分析提高酿酒酵母应对各种胁迫的技术方案，为行业共同解决高体积分数乙醇发酵提供思路。

1 酿酒酵母的耐受机制

1.1 酿酒酵母的醇类耐受机制

乙醇作为酿酒酵母的主要代谢产物，虽然酿酒酵母对乙醇具有较高的耐受性[6]*，但仍对乙醇的毒性作用很敏感。随着发酵时间延长，乙醇体积分数升高，进而对酵母的生长产生抑制作用。酵母在发酵过程中能通过调节代谢来保证自身的正常生长，即产生乙醇耐受性。酵母的乙醇耐受性能取决于很多方面，其中酵母细胞结构和自身遗传基因对其耐受性起着关键作用[8]*，主要包括热激蛋白合成基因、海藻糖合成酶基因[9]*及脯氨酸、精氨酸和色氨酸的tRNA基因tR（ACG）D和亮氨酸tRNA基因tL（CAA）K[10-11]*。HSP编码基因可在乙醇的促使下合成特定的热激蛋白，能起到稳定细胞膜和蛋白质的作用，通过应激反应减弱乙醇对细胞的毒害作用，从而提高酿酒酵母乙醇耐受性[12]*。乙醇体积分数升高时，这些基因会被激活合成相关蛋白和海藻糖，增强酵母对乙醇的抵抗能力；其中海藻糖和脯氨酸可以防止蛋白质变性、减少膜的渗透性改变，海藻糖是细胞在环境胁迫下的应激产物；脯氨酸是一种渗透保护物质，可保护和维持生物大分子物质在胁迫环境下的稳定性，被认为是酵母对胁迫因素耐受性的重要指标[13]*。丁醇异构体对酵母细胞的毒性要比乙醇大得多，通过增加热休克蛋白70、敲除关键基因可以增加异丁醇耐受性[14]*；其中参与蛋白质降解的基因对细胞耐受丁醇异构体很重要，但和耐受乙醇的能力不相关[15]*。

1.2 酿酒酵母的高温耐受机制

温度作为影响酵母菌生长的重要因素，会影响酵母菌的酶活性以及对营养物质的吸收和利用，而不同的酵母菌对温度的耐受性也不同[16]*。边明鸿等[17]*从发酵的桑葚果酒中筛选的异常威克汉逊酵母可在36 ℃的高温环境下生长。酵母菌的耐热机制涉及多个生理过程的变化，其中诱导表达热激蛋白的过程起主导作用[18]*，细胞内热激蛋白基因HSP104的大量表达可以提高酵母的耐热性[19]*；在耐热性很差的刀豆（HSP101缺陷型）中导入酵母HSP104基因并使之正常表达，刀豆的耐热缺陷很快就得到弥补并恢复正常[20]*。海藻糖对提高温度耐受性也有显著作用[21]*。

1.3 酿酒酵母的高渗耐受机制

高体积分数乙醇发酵所面临的主要挑战就在于酵母对渗透压的耐受能力，酵母菌对渗透压的胁迫存在多种调节途径，如高渗透压甘油（HOG）途径和Yap1/skn7介导的途径分别专门参与对渗透性和氧化应激的反应。HOG-MAPK途径和耐高渗有密切关系，其调控机制主要在于通过信号传递激活3-磷酸甘油脱氢酶基因（gpd1、gpd2等），促使渗透物甘油等的合成，从而改变细胞的渗透势来提高酵母耐高渗能力[22]*。除此之外，海藻糖的合成对酵母耐高渗也有一定影响，不同发酵底物使得异常威克汉逊酵母对糖的耐受性不同，并从自然发酵果蔬酵素中分离得到耐高糖能力的异常威克汉逊酵母，这为耐高渗发酵剂的使用提供实践经验[23]*。另外，Elp3基因影响酿酒酵母的咖啡因耐受性，其和耐高渗性能方面也有密切关系[24]*。

2 提高酿酒酵母耐受性的方法

在乙醇发酵过程中，以生产效益为导向的过程管理中会迫使酿酒酵母处于严重的不平衡状态，即高温、高渗透、高底物浓度和高乙醇体积分数等环境因子的胁迫，对酿酒酵母的生长和代谢产生严重影响。因此，高性能生产菌株和高水平工艺控制的根本目标就是提高酵母的耐受性，使其在特殊环境中也能维持正常的生长和代谢。关于提高酿酒酵母耐受性的方法有很多，如菌种改良、培养基优化、添加辅助因子等均取得一定进展。

2.1 菌种改良提高酵母耐受性的方法

菌种改良方法包括自然选育、传统诱变育种和现代基因工程。自然选育是产业界较为常用的方法[25]*。而诱变育种可以提高突变频率和变异谱，更容易获得高产菌株。溴化乙锭是常用诱变剂，利用溴化乙锭诱变筛选出呼吸链缺陷型酵母菌株，在42 ℃高温下维持较高的生长能力和发酵能力，与对照菌株相比乙醇产量高出2倍[26]*。但是诱发突变的随机性比较大，要进行大规模的筛选工作才能获得良好效果，且变异菌株不稳定，易出现回复突变。现代基因工程是通过基因组改造技术来实现对菌种改良，如全局转录因子工程[27]*、基因组多重位点自动改造技术[28]*等，这些方法可在短时间里获得优良的菌种，是已报道最先进的微生物育种技术。在gln3D酵母菌株中删除GLN3，增强工程菌株的耐受性，并使异丁醇产量提高4.9倍[29]*。王灏等[30]*通过基因组改组技术对酿酒酵母进行2次改造后，得到耐热和发酵性能较好的菌株，使其可在35℃条件下有较高的乙醇产量；也可通过表达GLN1基因，提高酿酒酵母的谷胱甘肽含量，使其对糠醛的耐受性得到提高，乙醇产量也提高了5.3倍[31]*。当然，控制酿酒酵母耐受性的调控基因数量达几百个，涉及很多亚细胞结构的变化，很难确定在提高酵母耐受的同时，不影响其他发酵性能。利用基因组改造和适应性进化筛选获得的酿酒酵母菌株S.C D 12，工业小试发现其在35 ℃高温下仍能保持良好的乙醇产量和较低的残糖，适合于工业化生产，能极大节约工业上冷却水的使用，降低发酵成本[32]*。也可以通过HAA1蛋白的过表达，提高酿酒酵母的乙酸耐受性[33]*。由pntAB编码的7个大肠杆菌反应，edd、pfl、pps、maeD、ppc和mdh作为胞质反应添加到酿酒酵母的骨架代谢模型中，能弥补结构差异，改善了酿酒酵母的生产力[34]*。在产乙醇的大肠杆菌KO11菌株中过表达isc系统，可以提高乙醇耐受性和ADH活性，以及将醋酸合成的代谢通量转向乙醇以提高乙醇产量[35]*。

2.2 优化培养基提高酵母耐受性的方法

在工业发酵的生产中，培养基既是酿酒酵母的生存环境，也是其营养物质的主要来源，能够直接影响酵母的生长和代谢。发酵培养基的设计和优化在整个工业发酵中有着举足轻重的地位。通过对原有培养基成分进行配比和不同的试验设计方法，实现酿酒酵母对不同胁迫因素的耐受性增加，进而实现发酵产物的提高。在秸秆发酵乙醇的研究中发现，里氏木霉（Trichoderma reesei）T12菌株产纤维素酶活力提高115%，秸秆被转化为乙醇的量得到提升[36]*。在酵母发酵过程中，向培养基中添加磷酸二氢钾、硫酸镁和尿素，乙醇产量提升20 g/L，达到原本最高产量的119%[37]*。优化培养条件，可以提高酵母生物量[38]*，更会对乙醇代谢起到促进作用，达到事半功倍的效果[39]*。褚金磊等[40]*通过响应面法优化最适培养基在该培养基条件下发酵12 h，胞内巯基含量最高可达1.82%，比未优化前提高60%，使得酿酒酵母的抗氧化性提高、乙醇产量增加，为后期进行高密度工业化发酵奠定基础。

2.3 添加辅助因子提高酵母耐受性的方法

通过在发酵过程中添加相关的辅助因子既能够促进酵母生长、增强代谢、弥补酵母营养缺失的物质，如表面活性剂、发酵助剂及一些金属离子，还可以增强酵母对乙醇的耐受性，从而增加乙醇产量。可通过添加钾离子或缓冲液来限制培养基的酸化，增加酵母对乙醇的耐受性，提高乙醇滴度进而增加乙醇的耐属性提高酒精产量[41]*。也可以添加锌提高酵母细胞对乙醇、高温和乙酸的耐受性[42]*，在0.1 mm Zn2+*条件下酵母菌达到最大的活力、生物量和乙醇产量[43]*。在石榴酒发酵中添加发酵助剂VVR（主要含硫酸铵盐和无机盐）可以提高发酵速率和乙醇产量[44]*；法国LALLEMAND生产的发酵助剂（含酸性物质）在山葡萄酒的发酵中可以提高糖的利用率[45]*。杨昳津等[46]*通过添加外源物观察酵母Et20的耐受性，得出硬脂酸能最大限度提高酿酒酵母菌株Et20的乙醇耐受性，促进酵母Et20在乙醇胁迫下的生长，又提高酵母Et20的发酵强度。超高体积分数（VHG）乙醇发酵过程添加乙醛，发酵结束的乙醇体积分数达17%（对照的乙醇浓度为7%）[47]*。惠继星等[48]*总结表明乙醛由酵母通过代谢途径产生，作为代谢的一个节点，乙醛既能还原成乙醇又能氧化成乙酸。将酒糟多肽作为天然产物添加到糖蜜培养基中可以促进酵母的生长代谢和发酵性能，而且有助于酵母抵抗高渗透压和乙醇体积分数[49]*，添加0.5%大豆肽能有效促进酵母生长，增加抗逆性并提髙发酵速率[50]*。在发酵体系中添加不同体积分数的乙偶姻能够促进碳源更多地分配给2, 3-BD的合成途径，从而增加乙醇产量[51]*。通过低强度的超声处理，也可在不改变酿酒酵母耐受性的前提下使得酿酒酵母的生物量增加127.03%[52]*。

3 结语与展望

燃料乙醇可替代化石能源，有利于绿色发展，符合国家安全需要；充分利用农林废弃物为原料，可以助力解决“三农”问题。近年来，我国燃料乙醇产业发展取得长足进步，但是相比于美国、巴西等国家，中国仍面临原材料供应不稳定、产业链不完整、竞争平台不公平等问题，严重阻碍燃料乙醇的发展进度[53]*。

从技术开发和生产管理角度来看，发酵工艺和菌种问题是整个产业的核心所在。工艺方面主要在于提高发酵温度从而减少冷凝水的使用；乙醇发酵工业在降本增效问题上，更加关注对菌株的耐受性改造。通过了解酿酒酵母的生长代谢和耐受机制，通过过表达某些基因增酿酒酵母对特异性耐受性，通过对优良菌种的筛选获得最大效益的菌株进行培育，除以之外通过改良培养基的营养成分和插入重组质粒诱导育种出高抗逆性酵母菌株，将作为研究的主流方向。随着科技的进步，对酵母耐受性能的研究技术也会不断突破，更多优秀的品种有望应运而生，并在工业生产中实现大规模应用，发展前景十分广阔。