基于SNAIL 信号通路及肠道菌群研究密点麻蜥抑制胃癌肝转移的作用机制

白 星，程翻娥，杨长沅，李 铮，李卫强,

1.宁夏医科大学中医学院，宁夏 银川 750004

2.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510006

3.宁夏少数民族医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川 750004

胃癌是世界第4 大恶性肿瘤[1]，由于其发病隐匿、早期不易诊断且胃癌细胞具有循环扩散性，大多数患者在确诊时已发展为晚期胃癌或伴有转移。其中，肝脏是胃癌细胞血行转移最常见的器官，其临床治疗仍是亟待解决的难题[2-3]。人类肠道菌群中既包含致癌菌群又包含抑癌菌群，共同维护肠道黏膜稳态环境，癌症的发生及转移与肠道菌群失调密切相关[4]。研究表明，胃癌肝转移患者肠道菌群存在紊乱现象[5]。因此，从浸润转移相关的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及肠道菌群调控等多靶点开展干预胃癌肝转移的作用及机制阐释为中医药抗癌研究提供科学依据具有重要意义。

EMT 是上皮细胞获得间充质细胞表型的过程[6]。这一生物过程常被癌细胞利用则致使癌细胞具有抗凋亡、获得侵袭等癌细胞特性。EMT 是肿瘤转移的重要标志，SNAIL 是EMT 的标志物，能够抑制Ecadherin 的表达，促进EMT 进程[7]。SNAIL 的异常激活与肿瘤的发生与转移及其预后密切相关[8]。

密点麻蜥Eremias multiocellataGünther 始载于《中国药用动物志》[9]，《本草纲目》载蜥蜴有活血化瘀、消瘿散结之功。本课题组前期开展了密点麻蜥及其为主组成的复方中药干预胃癌的相关研究，证实密点麻蜥含药血清能够抑制胃癌SGC-7091 细胞的增殖，抑制Sirt1 表达，降低p53 蛋白表达，促进胃癌细胞的调亡[10]；其复方能够改善癌前病变大鼠病理形态，降低p53 和PUMA 表达，逆转癌变趋势[11]，且阐明蜥蜴复方中药能够通过上调Ecadherin、下调整合素β1和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）表达，阻断EMT，抑制胃癌浸润转移[12]。本课题基于以上前期研究，进一步探索密点麻蜥基于SNAIL 信号通路影响EMT及肠道菌群调节，从多途径、多靶点对胃癌肝转移的抑制作用及机制。

1 材料

1.1 动物

SPF 级雄性BALB/c 裸鼠36 只，4 周龄，体质量（20±2）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK（京）2021-0006。动物饲养于宁夏医科大学实验动物中心SPF 级动物房，恒温（22±1）℃，光照昼夜交替各12 h，自由进食饮水。动物实验经宁夏医科大学实验动物伦理审查委员会批准（批准号2021-091）。

1.2 细胞株

人胃腺癌HGC-27 细胞株购自上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.3 药材

密点麻蜥（批号20180501）购自宁夏医科大学附属中医医院门诊，经宁夏医科大学药学院刘艳华教授鉴定为密点麻蜥E.multiocellataGünther。

1.4 药品与试剂

5-氟脲嘧啶（5-fluorouracil，5-FU，批号2005181）购自天津金耀药业有限公司；苏木素-伊红（HE）染色液（批号202010）购自北京博奥拓达科技有限公司；兔抗鼠β-actin 多克隆抗体（批号12w2944）、SNAIL 多克隆抗体（批号78m6660）、E-cadherin 多克隆抗体（批号32p9942）、N-cadherin多克隆抗体（批号12j8872）多克隆抗体购自Affinity Biosciences；HRP 标记的山羊抗兔IgG 抗体（批号ATTNO0301）购自亚科因生物技术有限公司；E.Z.N.A.®DNA 提取试剂盒（批号M9636020000J13V）购自美国 Bio-Tek 公司；AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒（批号11214KA1）购自Axygen Biosciences；Quantus™ Fluorometer 检测试剂盒（批号0000302722）购自美国Promega 公司。

1.5 仪器

CO2培养箱（美国Thermo Fisher Scientific 公司）；CKX53 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）；RM2255 型全自动轮转式石蜡切片机（德国Leica 公司）；MiniProteanTetra 蛋白电泳系统（美国伯乐公司）；Amersham Imager 680RGB 型超灵敏多功能成像仪（美国GE 公司）；NovaSeqpE250 型平台（美国Illumina 公司）。

2 方法

2.1 胃癌肝转移模型制备、分组与给药

36 只雄性BALB/c 裸鼠按照随机数字表法随机分为对照组（9 只）和造模组（27 只）。参考相关文献，采用脾脏注射法[13]建立胃癌肝转移模型。造模动物苏醒后，隔天对伤口进行碘伏消毒处理。饲养4 周并对其精神状态、活动度、体质量饮食、皮肤颜色、肿瘤生长等情况进行隔日观察记录。造模4周时，随机取对照组1 只与造模组3 只剖腹探查验证造模成功。对照组裸鼠肝组织色泽鲜明、表面光滑；造模组裸鼠肝组织出现肉眼可见白色结节，肝脏受损，部分肝组织被转移性结节代替，表明胃癌肝转移模型构建成功。

造模成功的裸鼠按照随机数字表法随机分为模型组、5-FU（0.025 g/kg）组和密点麻蜥（2.6 g/kg，临床等效剂量）组，每组8 只，并由第3 方对实验组进行随机编码，编号为不透明的密封信封以避免选择性偏倚。

取密点麻蜥5.2 g，加入纯水定容至600 mL，浸泡30 min，放入数显恒温加热电热套中100 ℃煮沸后，将温度调至80 ℃，煎煮至300 mL 时滤过，继续80 ℃加热至200 mL，制备成终质量浓度为0.026 g/mL 的水煎剂。密点麻蜥组ig 水煎剂，2 次/d；5-FU组ip 5-FU 原液稀释10 倍后的溶液，1 次/d，对照组和模型组ig 生理盐水，连续4 周。

2.2 样本采集

用无菌EP 管收集各组裸鼠末次给药2 h 后的新鲜粪便，迅速转移至-80 ℃保存。各组小鼠ip 2%戊巴比妥钠麻醉，取一小块肝组织以生理盐水冲洗后，于4%多聚甲醛中固定24 h，剩余肝组织于-80 ℃保存备用。

2.3 肝组织病理观察

取固定好的肝组织，冲水后脱水、透明，石蜡包埋，切成4 μm 厚的石蜡切片，脱蜡水化后蒸馏水冲洗5 min，苏木素染色4 min，水洗多余染液，盐酸酒精分化，水洗15 min，伊红染色3 min 后蒸馏水冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，滴加中性树胶封片。晾干后用切片扫描仪观察。

2.4 肝组织SNAIL、E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表达检测

取各组裸鼠肝组织100 mg，加入含蛋白酶抑制剂的裂解液1 mL，用冷冻研磨仪低温研磨至充分裂解，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，吸取上清。BCA 法测定蛋白浓度。蛋白样品经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，加入无蛋白快速封闭液封闭15 min，TBST 洗涤5 次，每次5 min，加入一抗（1∶1000），4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤5 次，每次5 min，加入二抗（1∶10 000），室温孵育2 h，TBST 洗涤5 次，加入ECL 发光试剂显影，采用Image J 软件分析条带灰度值。

2.5 裸鼠粪便DNA 提取及IIluminaNovaSeq 测序

将每组裸鼠的粪便混合后，用E.Z.N.A.®DNA提取试剂盒抽提肠道微生物总DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量，用引物 338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）对V3～V4 可变区基因进行PCR 扩增，95 ℃预变性3 min，27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸30 s），72 ℃稳定延伸10 min，4 ℃进行保存。PCR 反应体系：5×TransStart Fastpfu 缓冲液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，TransStart Fastpfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，双蒸水补足至20 μL。每个样本6 个重复。

使用2%琼脂糖凝胶回收同一样本PCR 产物，利用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行回收产物纯化，2%琼脂糖凝胶电泳检测，用 Quantus™Fluorometer 检测试剂盒对回收产物进行检测定量。送由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。分别用Ace、Sobs、Shannon 和Simpson 指数测定α-多样性。用Bray-Curtis 计算β-多样性，主坐标分析可视化，R 软件绘制结果来比较不同样本菌群丰富度和多样性。

2.6 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件进行统计分析，对定量资料进行正态性检验，符合正态分布的用表示；非正态分布的采用中位数（四分位数）［M（Q1，Q3）］表示。两组间比较方差齐且符合正态分布采用StudentT检验，方差不齐且不符合正态分布用Wilcoxon 秩和检验。多组间比较采用单因素方差分析单因素方差分析（One-way ANOVA）或Kruskal-Wallis 秩和检验。

3 结果

3.1 密点麻蜥对胃癌肝转移裸鼠肝组织病理变化的影响

如图1 所示，对照组肝组织细胞排列整齐，肝小叶结构完整；模型组癌细胞在肝组织内聚集成灶性，肝小叶破坏，癌细胞核大、固缩、深染，异性明显，肝细胞水肿可见炎细胞浸润，部分可见肝组织坏死；5-FU 组和密点麻蜥组肝组织病灶变小，肝细胞较模型组排列整齐，炎性细胞减少，肝细胞表现出新生性，病变均有改善。

3.2 密点麻蜥对胃癌肝转移裸鼠肝组织SNAIL、Ecadherin 和N-cadherin 蛋白表达的影响

如图2 和表1 所示，与对照组比较，模型组裸鼠肝组织SNAIL 和N-cadherin 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.001），E-cadherin 蛋白水平显著降低（P＜0.001）；与模型组比较，密点麻蜥组SNAIL 和N-cadherin 蛋白表达水平均显著降低（P＜0.001），E-cadherin 表达水平显著升高（P＜0.001）。

表1 密点麻蜥对胃癌肝转移裸鼠肝组织中SNAIL、E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表达的影响 (,n=8)Table 1 Effect of E.multiocellata on SNAIL,E-cadherin and N-cadherin protein expressions in liver tissue of nude mice with gastric cancer of liver metastasis (,n=8)

表1 密点麻蜥对胃癌肝转移裸鼠肝组织中SNAIL、E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表达的影响 (,n=8)Table 1 Effect of E.multiocellata on SNAIL,E-cadherin and N-cadherin protein expressions in liver tissue of nude mice with gastric cancer of liver metastasis (,n=8)

与对照组比较：***P＜0.001；与模型组比较：#P＜0.05 ###P＜0.001***P ＜ 0.001 vs control group;#P ＜ 0.05 ###P ＜ 0.001 vs model group

图2 密点麻蜥对胃癌肝转移裸鼠肝组织中SNAIL、Ecadherin 和N-cadherin 蛋白表达的影响Fig.2 Effect of E.multiocellata on SNAIL,E-cadherin and N-cadherin protein expressions in liver tissue of nude mice with gastric cancer of liver metastasis

3.3 密点麻蜥对胃癌肝转移裸鼠肠道菌群的影响

3.3.1 稀释曲线 Rank-Abundance 曲线用来反映物种的均匀度和丰富度，横坐标宽度代表物种丰度，纵坐标平滑度表示物种均匀度，曲线平滑下降且水平延伸表示物种丰度高且均匀，陡然下降则表示优势菌群所占比例较高均匀度较低。如图3-A 所示，对照组和密点麻蜥组优势菌群所占比较高，密点麻蜥组和5-FU 组物种丰富度较高。

稀释曲线用于评价测序深度能否反映总体所包含的每个样本微生物多样性，也可以比较相同的测序深度下不同样本操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）数。如图3-B 所示，横坐标代表测序量，纵坐标表示多样性指数。使用Shannon算法的稀释曲线测序量在400 时，Shannon 曲线走向平缓，曲线较长且集中在平缓，说明在本实验中继续增加测序量产生新的物种较少，测序数据量能够反映样本生物信息。

图3 物种等级丰度图 (A) 和Shannon 稀释曲线图 (B)Fig.3 Species Rank-abundance curve (A) and Shannon dilution curve (B)

3.3.2 α 多样性指数组间差异 sob 指数代表物种实际观测丰度，Shannon 指数反映菌落的多样性，Chao 指数反映物种的丰富度，pd 指数反映菌群进化谱系多样性。如图4 所示，与对照组比较，模型组sob 指数和pd 指数均显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，5-FU 组和密点麻蜥组sob 指数和pd 指数均显著降低（P＜0.05、0.01），密点麻蜥组Shannon指数显著降低（P＜0.05）。结合多样性指数和均匀丰富度，胃癌肝转移裸鼠肠道菌群与对照组比较表现菌群失调趋向，经密点麻蜥治疗后更接近对照组。

图4 各组肠道菌群的α 多样性分析 (,n=6)Fig.4 α Diversity analysis of gut microbiota in each group (,n=6)

3.3.3 β 多样性分析 偏最小二乘法-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）将多组数据间差异反映在坐标中，坐标中样品的距离越接近，表明其样品结构相似性越高，反之差异性越显著。如图5 所示，模型组与对照组肠道菌群构成表现出差异；5-FU 组与密点麻蜥组结构接近，与模型组有一定的距离，更接近对照组，表明密点麻蜥可以调节胃癌肝转移裸鼠肠道菌群的结构。

图5 各组肠道菌群β 多样性的PLS-DAFig.5 PLS-DA of β diversity of gut microbiota in each group

3.3.4 肠道菌落物种组成分析 如图6-A 和表2 所示，在门水平上各组胃癌肝转移裸鼠肠道菌群相对丰度＞1%的菌群有厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、变形菌门（Proteobacteria）、疣微菌 门（Verrucomicrobiota）、放线菌门（Actinobacteriota）。与对照组比较，模型组厚壁菌门丰度降低，拟杆菌门丰度升高；与模型组比较，密点麻蜥组厚壁菌门丰度升高。厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）可反映胃肠整体健康状况，与对照组比较，模型组F/B 值下降；经5-FU 和密点麻蜥干预后F/B值均升高。如图6-B 所示，在属水平各组占比差异较大的菌属为拟杆菌属Bacteroides，各组在拟杆菌属的丰度比例为对照组20.57%、模型组28.39%、5-FU 组5.71%、密点麻蜥组9.49%。

图6 门 (A) 和属 (B) 水平肠道菌群物种组成分析Fig.6 Species composition analysis of intestinal flora at phyla (A) and genus (B) levels

表2 密点麻蜥对胃癌肝转移裸鼠肠道菌群拟杆菌门和厚壁菌门的影响 (,n=6)Table 2 Effect of E.multiocellata on Firmicutes and Bacteroidota in gut microbiota of nude mice with liver metastasis of gastric cancer (,n=6)

表2 密点麻蜥对胃癌肝转移裸鼠肠道菌群拟杆菌门和厚壁菌门的影响 (,n=6)Table 2 Effect of E.multiocellata on Firmicutes and Bacteroidota in gut microbiota of nude mice with liver metastasis of gastric cancer (,n=6)

3.3.5 属水平物种差异分析 如图7 所示，属水平各组间差异显著的菌群主要有norank_f__Muribaculaceae、拟杆菌属、乳酸杆菌属Lactobacillus、梭状芽孢杆菌属Clostridia_UCG-014、副拟杆菌属Parabacteroides、幽门螺旋杆菌Helicobacter。其中norank_f__Muribaculaceae 在模型组较对照组丰度增加，经5-FU 和密点麻蜥治疗后为表现出下降趋势；拟杆菌属在各组间丰度差异显著，与对照组相比模型组中显著富集（P＜0.05），经密点麻蜥治疗后丰度显著下降（P＜0.01）；与对照组相比模型组中乳酸杆菌属丰度降低，经药物治疗后未见显著调节作用；与对照组相比，Clostridia_UCG-014 在模型组中占比下降，经密点麻蜥干预后显著提高，各组间差异显著（P＜0.001）。副拟杆菌属在模型组中较对照组显著提高（P＜0.05），经药物治疗后丰度下降接近对照组（P＜0.001）。幽门螺旋杆菌在模型组中的丰度明显增加（P＜0.01），经药物干预后恢复生理水平（P＜0.01）。密点麻蜥主要对胃癌肝转移裸鼠肠道中拟杆菌属、梭状芽孢杆菌属、副拟杆菌属、幽门螺旋杆菌进行调节。

图7 属水平物种差异分析Fig.7 Analysis of species differences at genus level

4 讨论

目前胃癌的治疗手段主要是手术切除、围术期放化疗及分子靶向治疗。但肿瘤的远处转移常常影响手术的可行性，且一部分病人对于化疗药物表现为不耐受以及耐药等一系列问题仍亟待解决。研究发现中医药通过多途径多靶点对肿瘤具有较好的治疗作用[14]。因此探究中药抗癌机制为临床提供科学依据、促进药物研发具有重要意义。

在肿瘤形成中SNAIL 可抑制E-cadherin 的转录从而诱导EMT 发生，促进癌细胞增殖、抗调亡及转移[15]。另外SNAIL 诱导的EMT 可以通过抑制宿主的免疫监视能力促进肿瘤的转移及复发[16]。本研究发现，与对照组比较，模型组SNAIL 和N-cadherin蛋白表达上调，E-cadherin 表达下调，蛋白表达上调；与模型组比较，密点麻蜥上调E-cadherin 表达，下调SNAIL、N-cadherin 的表达，表明密点麻蜥可能通过抑制转录因子SNAIL 的表达，增加Ecadherin 表达调控EMT 的进程，对胃癌肝转移裸鼠模型具有较好的抑制作用。

近年研究表明，肠道菌群成分与癌症发生有关。其中肠道菌群产生的短链脂肪酸（short-chain fattyacids，SCFAs）在细胞稳态中至关重要，它们有助于调节组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC），从而影响细胞附着、免疫细胞迁移、细胞因子产生、趋化性和程序性细胞死亡[17]。SCFAs 能够作用于乳腺癌细胞表面的G 蛋白偶联受体，调节肿瘤抑制基因，使癌细胞E-cadherin 表达升高、应力纤维含量降低，阻断EMT 进展[18]。因此，通过改变肠道菌群结构来控制SCFAs 水平亦可抑制肿瘤。

机体SCFAs 中的丁酸主要由厚壁菌门产生[19]。本研究中胃癌肝转移裸鼠肠道菌群中厚壁菌门在对照组丰度占比40.9%，模型组中厚壁菌门的丰度为26.4%。经密点麻蜥干预后厚壁菌门的丰度提高到30.2%。与对照组比较，拟杆菌门在模型组中丰度显著提高，经5-FU 治疗后丰度下降，密点麻蜥干预后未见改变。F/B 值可反映胃肠整体健康状况，是诊断菌群紊乱的标志，与对照组比较，模型组F/B 值下降，表明胃癌肝转移发生后裸鼠肠道菌群发生紊乱，经5-FU 和密点麻蜥干预后F/B 值均提高，因此证实密点麻蜥可调节菌群失调。本课题组前期研究发现胃癌肝转移裸鼠肠道中厚壁菌门丰度下降，且以密点麻蜥为主药的复方表现出提高胃癌肝转移裸鼠肠道厚壁菌门丰度的作用，因此表明密点麻蜥可通过增加厚壁菌门的丰度，补充机体SCFAs 的缺失来抑制胃癌[20]。

属水平上，密点麻蜥主要对胃癌肝转移裸鼠肠道中拟杆菌属、梭状芽孢杆菌属、副细菌属、幽门螺旋杆菌属进行调节。其中拟杆菌属和副细菌属的生理功能相似，均可代谢碳水化合物和产生SCFAs，对宿主健康和免疫调节有益[21]。副细菌属还表现锁定肿瘤坏死因子的释放发挥对肿瘤的抑制作用[22]。梭状芽孢杆菌能够诱导宿主肠道T 细胞反应表型从而发挥对人体免疫调节的作用[23]。幽门螺旋杆菌属是胃癌发生的主要原因，根除幽门螺旋杆菌可降低SNAIL 的表达，增加E-cadherin 从而抑制EMT 的发生[24]。同时幽门螺杆菌影响成纤维细胞向具有肿瘤相关成纤维细胞特征的细胞方向分化，可能在上皮RGM-1 细胞中启动EMT 过程，表明幽门螺旋杆菌属具有诱导胃癌发生且影响转移[25]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组中幽门螺旋杆菌属丰度增加，经密点麻蜥干预后幽门螺旋杆菌属丰度降低，表明密点麻蜥可降低幽门螺旋杆菌属而抑制胃癌。

以上研究表明，密点麻蜥能够通过降低转录因子SNAIL 蛋白表达，增加E-cadherin 蛋白表达，降低N-cadherin 蛋白表达而改变EMT 进程，发挥对胃癌肝转移的抑制作用。同时可能通过调节肠道菌群稳态平衡，增加产生SCFAs 菌群厚壁菌门丰度，降低致癌菌属幽门螺杆菌丰度，调节机体免疫和SCFAs 相关菌属（拟杆菌属、梭状芽孢杆菌属、副细菌属）的丰度，发挥对胃癌的抑制作用。

本研究基于SNAIL 信号通路影响EMT 及调节肠道菌群，阐释了密点麻蜥从多途径多靶点对胃癌肝转移的抑制作用及机制，为密点麻蜥治疗胃癌肝转移提供一定的实验证据，下一步将从通路-SCFAs-SCFAs 相关菌群，宏基因层面进一步揭示密点麻蜥多途径、多靶点治疗胃癌的作用机制。此外，密点麻蜥作为蜥蜴科的动物药，目前药物提取和成分鉴定一直是一个难题。本课题组前期与南京中医药大学段金廒教授合作对复方蜥蜴散在动物体内的代谢产物进行初步鉴定，由于相关药物研究较少尚未查询到可以做质谱的对照品，具体蜥蜴成分仍未明确。目前课题组仍在进行密点麻蜥单味提取及成分鉴定工作。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突