基于SystemXc-/GPX4轴调控的铁死亡在脑卒中后的研究进展

吴 松,杨悦悦,陈 净综述,任彬彬审校

0 引 言

细胞是除病毒外所有生物体结构和功能的基本单位,对维持新陈代谢、促进生长发育、执行机体生理功能、维持内环境稳态等有重要的作用。生理状态下,细胞可在基因调控下发生主动性死亡,如凋亡等;随着研究的深入,越来越多的细胞死亡形式被发现。近年来,铁死亡成为脑卒中后损伤神经细胞的重要机制。也有研究表明,铁螯合剂等可抑制铁死亡的发生[1]。本文就铁死亡在脑卒中后的作用机制与抑制铁死亡的相关研究作一综述。

1 铁死亡的提出

铁死亡方式与以往人们所能认识到的细胞自噬、坏死和凋亡有所不同,实际上是一个较新出现的细胞程序性死亡方式,表现出细胞对金属铁离子有很强程度的依赖性及胞内有大量脂质过氧化物(lipid hydroperoxide,LPO)累积的特点[2]。LPO是由多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)链经自由基或活性氧(ROS)作用后形成带有过氧基的脂质。即在铁死亡过程中铁和LPO的积累起着关键作用。当细胞线粒体内的铁含量超载时,因PUFA的氧化过程可被抑制剂所抑制(如铁螯合剂-去铁胺DFO、亲脂抗氧化剂和维生素E等),因此Dixon 等[3]在2012年正式将其命名为铁死亡。铁死亡在基因、形态学、生化水平上有别于凋亡、自噬等已知的死亡方式。从基因层面讲:铁死亡过程受到多种基因调控,主要通过铁代谢紊乱、脂质过氧化物堆积、氨基酸代谢、氧化应激等途径。在形态学上:铁死亡以线粒体结构变化为主,线粒体皱缩变小和体内嵴膜减少、消失是常见的特征;此外,也会出现膜密度增加、线粒体外膜破裂等现象;但细胞核的形态和结构常常不会发生变化,这呈现出了与其他死亡形式所不同的典型特征[4]。在生化水平上,胞内谷胱甘肽(glutathione,GSH)常因耗竭而表现为含量较低,因此谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)本身的抗氧化活性也将会受到影响(即抗氧化的能力会减弱);由于二者本身都具有很强的抗氧化能力以有效对抗膜的脂质过氧化。所以在其浓度降低或抗氧化活性又遭到严重抑制时,GPX4就无法及时有效降解胞内LPO,最终直接造成了细胞的铁死亡[2]。综上,细胞是否发生了铁死亡,检测铁依赖性的LPO堆积量是最重要的标志[5]。

2 脑卒中和铁死亡

“脑卒中”(cerebral stroke)又名为"中风"、"脑血管意外"(cerebralvascularaccident,CVA),是患者大脑毛细血管的骤然痉挛断裂(脑出血)或血管阻塞(脑梗死)而造成大量血液无法从大血管流入脑部,进而使受损伤部位的脑组织缺血、缺氧而导致脑神经细胞死亡的一种急性脑血管病变。我们知道,人肢体的运动功能和深、浅感觉等均由神经支配。神经系统受损后,患者就无法自主支配肢体运动,严重的甚至将丧失听理解能力、言语能力和吞咽能力;给家人和社会带来沉重的负担[6]。脑卒中有出血性卒中和缺血性卒中两种发病形式;其中缺血性脑卒中最为常见,约占85%[7]。目前,治疗脑卒中的手段种类繁多,如针对缺血性脑卒中可采用溶栓疗法、抗凝治疗和抗血小板疗法等[8]。脑卒中后的继发性损伤机制,在近年来的研究中也日渐明了。脑卒中后神经细胞损伤是给身体带来严重危害的元凶,现据报道的损伤途径包括传统的细胞凋亡、自噬、氧化应激等[9];有研究表明,抑制以上途径并不能完全改善受损的脑组织和神经细胞[10]。于是推断:在脑卒中发生后很可能还存在其他使得神经细胞死亡的方式。幸运的是在一项针对雄性蒙古沙鼠脑损伤后脑皮质微量元素的研究中发现:使小鼠右大脑中动脉和右颈总动脉闭塞1h,致脑缺血,后检测得出脑皮质中铁(Fe)含量显著升高(铁超载),缺血脑中超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的抗氧化活性显著降低[11]。在Park等[12]和Ding等[13]的研究中也得到了类似的结论;然而,在使用了铁螯合剂、自由基清除剂或抗氧化剂后能有效预防这种损伤[14],以上实验都给我们的推断提供了有力证据。总之,当缺血性脑卒中发生后,所引发的神经细胞中抗氧化因子(如GSH和GPX4)的生成减少及缺血脑组织中LPO含量累积增加均可加快对神经细胞的毒性反应,加重脑组织损伤[15-16]。种种证据表明:铁死亡对于脑卒中后续进展至关重要。因此,抑制铁死亡进程是减轻脑卒中后继发性神经损伤和改善预后的有效途径。

3 铁死亡的发生机制

铁死亡因其复杂的反应过程导致人们很难探究出其明确的分子发生机制。近年来,经研究人员的不懈努力,可确定的是,铁死亡主要与以下几种机制有关:铁代谢紊乱、脂质代谢紊乱、氨基酸抗氧化系统失衡(System Xc-/GPX4轴的抑制或失活)等[17]。

3.1铁代谢紊乱铁死亡是铁依赖性的脂质过氧化物累积所致,因此探究铁与脂质过氧化物在此过程中的作用就显得格外重要。铁元素对于维持生物体内环境的稳态和生理功能是必不可少的矿物质,且在脑组织中广泛存在,在氧的运输、ATP及DNA的合成方面发挥着重要作用[18]。但铁超载即胞质内游离的Fe2+增多却会对细胞有损害作用。神经细胞摄取和排出铁在转铁蛋白( transferrin,Tf)的作用下保持动态平衡,在PH为7.4时,每分子Tf以最高效率结合两分子Fe3+,Transferrin Receptor(TfR1)是介导此转运过程的受体。TfR1是位于细胞表面的糖蛋白,其在结构上是通过二硫键将两个同源的二聚体的亚基连接而成。在摄取Fe3+时,其可将由Tf与Fe3+结合形成的全铁-Tf以细胞内吞的方式摄入胞内。而后,在弱酸环境下,Fe3+脱落成游离态;与此同时,在STEAP3的作用下,Fe3+被还原为以Fe2+的形式存在,进而被二价金属离子转运蛋白1(DMT1)释放到胞质内的不稳定铁池(LIP)中进行储存。最终,完成使命的Tf/TfR1以复合物的形式通过胞吐作用重新回到细胞表面,二者分离成脱铁-Tf。继而为下一环节的Fe3+转运做准备。在胞质内的二价铁离子,生理状态下,除满足正常的细胞代谢和储存外,多余的将被膜铁转运蛋白(ferroportin,Fpn)转移至细胞外,Fpn是目前已知的哺乳动物体内唯一可将Fe2+转出细胞的蛋白[19]。摄入、排出和储存铁在多种蛋白的共同作用下,维持细胞内铁元素含量的动态稳定。Tang等[20]和Jiang等[21]研究发现,通过p53/TfR1和PI3K/IPR2途径可增强TfR1摄取铁的能力,从而加重铁超载,造成铁死亡。储存铁的铁蛋白也可通过自噬降解作用,Ferritin将Fe2+释放造成铁超载,诱发铁死亡[22]。同样的,若蛋白表达能力或活性受到抑制造成了胞内铁超载,也会通过诱导过氧化氢(H2O2)与Fe2+发生的芬顿反应(Fenton),进而产生大量的脂质ROS,破坏细胞DNA造成铁死亡。另一方面,Fe2+也参与脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)催化脂质过氧化反应过程,也可导致细胞铁死亡[23]。

3.2脂质代谢脂质过氧化物堆积是造成细胞铁死亡的首要因素。胞质内发生脂质过氧化的酶促反应,有研究已基本确定了诱导铁死亡的有关基因,其中与脂质代谢有关的编码蛋白有酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-CoA synthetase long-chain familymember4,ACSL4)和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(Lysophosphatidylcholine Acyltransferase3,LPCAT3)。PUFAs如花生四烯酸(arachidonic acid,AA) 或肾上腺酸(adrenic acid,AdA)在ACSL4和LPCAT3的共同催化作用下,成为被酯化转变为磷脂酰二乙醇胺衍生物(phosphatidyl ethanolamine,PE)的首选底物,生成产物花生四烯酸-磷脂酰乙醇胺(AA-PE)和肾上腺酸-磷脂酰乙醇胺(Ada-PE),而后存在于内质网相关的隔室中。最终在Fe2+的作用下脂氧合酶 15(15-lipoxygenase,15-LOX) 将AA-PE和AdA-PE氧化为PE-AdA-OOH和 PE-AA-OH等过氧化物[24]。这些脂质过氧化物的累积将造成细胞的铁死亡,但维生素E可通过抑制15-LOX来调节此过程。据研究报道:极易氧化的PUFA的积累成为铁死亡的标志,且发生铁死亡的程度与其含量有密切关系[25]。因此,可得出结论:通过干预ACSL4/LPCTA3/15-LOX 脂质代谢通路可调节铁死亡[26]。

3.3氨基酸抗氧化系统铁死亡与氨基酸代谢有十分紧密的联系,氨基酸抗氧化系统调节铁死亡主要通过System Xc-/GPX4轴发挥作用。研究证明,铁死亡是LOX在铁的作用下通过磷酸化酶激酶G2(PHKG2)将多不饱和脂肪酸过氧化造成的。GPX4是谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)家族的一员,其可通过清除生成的脂质过氧化物,从而使细胞对铁死亡的敏感性降低;即将有毒性的脂质氢过氧化物(L-OOH)还原转化为无毒的脂质醇(L-OH)[27]。若GPX4的生成受到阻碍或者活性被抑制,则由脂质过氧化物堆积产生的细胞毒性作用就无法被阻止,造成铁死亡[28]。GSH是GPX4在清除过氧化物时充当还原剂的一种辅助因子,包括还原型(GSH)和氧化型(GSSG)。正常情况下,GPXs可催化GSH为GSSG,其中以还原型的GSH占比最大;在与GPX4的共同作用下可以与ROS发生化学反应,起到对细胞的抗氧化作用,保护细胞免受损伤。因此GSH的含量会直接影响GPX4的活性,若GSH耗竭,GPX4的抗氧化的能力也就无法完全消除体内脂质过氧化物,导致铁死亡。System Xc-是一种位于细胞膜表面上胱氨酸和谷氨酸之间的特异性反向转运的蛋白,是轻链溶质载体家族第七成员xCT(SLC7A11)和重链溶质载体家族3成员24F2hc(SLA3A2)通过二硫键连接而成[29],可1∶1的摄入胱氨酸(Cystine)的同时排出谷氨酸(Glutamate)[3],该转运过程的能量由细胞内高浓度的谷氨酸顺浓度差来提供而不消耗ATP,因此该转运过程极易受到细胞外高谷氨酸的抑制。证据表明:在缺血性脑卒中发生后,损伤脑组织细胞外的谷氨酸含量会增高,直接抑制胱氨酸的摄入[30],影响后续反应:胱氨酸进入细胞后,经过一系列酶促反应,迅速被还原为半胱氨酸,并分别借助半胱氨酸-谷氨酸连接酶、谷胱甘肽合成酶和ATP,最终合成GSH。因此,我们可以推断:通过干预System Xc-/GPX4轴上的任一环节,直接或间接的调节GPX4活性,可有效影响铁死亡进程,以期探索更多治疗脑卒中的靶点。

4 通过System Xc-/GPX4轴干预铁死亡

4.1 直接作用于GPX4的铁死亡与脑卒中硒元素是合成硒代半胱氨酸必须的微量元素,GPX4是GPXs家族中活性位点和调控区域含有硒代半胱氨酸的抗氧化剂之一。有学者发现:药理硒 (Se) 发挥保护神经元的作用可通过两个步骤实现,第一步通过激活转录因子 TFAP2c 和 Sp1,第二步增强 GPX4的表达和该转录程序(硒组)中的其他基因[31]。研究发现,将单剂量的硒输送到大脑中会使抗氧化剂 GPX4 的表达增强,发挥保护神经元的作用,从而有效改善卒中模型的神经功能。由此可推断:脑渗透性硒的全身给药以抑制细胞的铁死亡来改善功能是治疗脑卒中的一种有效方法;而RSL3是首先被我们熟知的GPX4抑制剂,其通过与硒代半胱氨酸共价结合直接抑制GPX4的活性,诱导铁死亡的发生[32]。

此外,GSH 是GPX4发挥抗氧化物的辅助因子,是GPX4的内源性诱导剂,直接影响GPX4的活性。在一项缺血性脑卒中小鼠模型中,有学者发现,在成年雄性大鼠 MCAO 后,用芝麻素(SES)进行治疗(30mg/kg bwt),结果表明大鼠缺血脑组织梗死体积减少、脂质过氧化物的生成减少、cleaved-caspase-3活化和GSH 活性增加;从而使GPX4的抗氧化性增强以提高脑卒中后神经保护能力[33]。也有研究发现,在对已建立的缺乏GPX4的模型鼠喂食缺乏维生素E(一种具有抗铁死亡活性的脂溶性抗氧化剂)的饮食中,海马神经退行性变和行为功能障碍的发生率加快,在用了铁死亡抑制剂后小鼠的神经退行性变被明显改善[34]。因此,维生素E可作为神经细胞发生铁死亡时的抑制剂。另外,FIN56能使诱导的细胞对铁死亡的敏感性提高[35]。其能促进GPX4的降解过程,且可通过与角鲨烯合成酶直接结合,而后使内源抗氧化剂辅酶Q10(CoQ10)耗竭,从而诱发铁死亡。FINO2可同时影响铁和GPX4而导致铁死亡:一方面,直接将不稳定的铁氧化,另一方面,直接将GPX4失活[36]。也有文献报道,化合物DPI7和DPI10也直接作用于Gpx4并诱导铁死亡[36]。

4.2作用于System Xc-的铁死亡与脑卒中在一项高良姜对沙土鼠I/R后海马神经元影响的研究中,学者发现,高良姜可通过激活 SLC7A11/GPX4 轴抑制铁死亡,使脑组织脂质过氧化物水平降低,以达到对海马神经元的保护作用[37]。

Erastin是一种直接作用在System Xc-转运体上的铁死亡诱导剂,通过抑制胱氨酸的摄取来减少GSH的生成,从而降低GPX4的活性,导致铁死亡[38]。p53在铁死亡中也扮演者极为重要的角色。其作用除所熟知的介导细胞周期停滞、衰老和凋亡等外。Jiang等[39]研究表示,p53 还可抑制System Xc-中的SLC7A11,导致胱氨酸进入胞内合成半胱氨酸的过程受到抑制,GSH的生成减少,间接影响GPX4的活性致使细胞对铁死亡敏感性增强。在一项铁死亡对蛛网膜下腔出血(SAH)后早期脑损伤(EBI)的影响研究中,Kuang等[40]在使用铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)对模型大鼠治疗后,发现大鼠SAH后上调P53抑制SLC7A11表达、降低GPX4活性的作用被抑制了。在小鼠MCAO模型中,Fer-1抑制铁死亡和增强神经保护作用也得到了印证[41]。

另外,核因子E2相关因子 2(Nrf2)也是铁死亡的重要调控因子,对GPX4、SLC7A11、TfR1等都有明显的影响[42-43]。黎玉环等[44]在试验中发现,对脑出血大鼠使用柚皮素(NAR)后,促进了Nrf2和SLC7A11表达,从而GSH、GPX4蛋白水平显著升高,抑制了神经细胞的铁死亡。有学者发现,Nrf2-Keap1 信号的激活上调SystemXc-中的SLC7A11表达,使其活性增加,转运氨基酸功能增强,提高肿瘤发生时细胞对铁死亡的抵抗力[45]。因此Nrf2也可为脑卒中的治疗提供新靶点。

5 结语与展望

综上表明,自铁死亡被发现以来,就在心血管疾病和癌症中扮演着极为重要的角色。通过本文综述,可知铁死亡机制与铁代谢、脂质代谢和氨基酸代谢通路有密切的联系;以及维生素E、硒元素、GSH、GPX4、脂质过氧化物、铁螯合剂、抗氧化剂等在铁死亡中的作用。尽管大量的试验证明脑卒中与铁死亡息息相关,但仍然有许多问题需要被进一步研究:铁死亡过程中最关键的启动因子是什么?已知调控铁死亡中发挥作用的物质的深层分子机制是怎样的?除动物实验等基础研究外,能否提供更多的临床证据?除此之外,基于已知的铁死亡机制研发更多的中药制剂以及铁死亡抑制剂如何在临床上使用,从而改善患者预后,将是治疗脑卒中的一个大胆尝试。