PHBV生物滤池深度脱氮过程中抗生素环丙沙星的同步去除规律及影响因素

迮思文，王宇晖，宋新山，黄威，许中硕*，张志兰

1.东华大学环境科学与工程学院

2.上海泽耀环保科技有限公司

抗生素类因其广泛存在于环境中而被认为是最严重的新污染物之一。抗生素类的过度使用和不合理处置使其积聚于市政污水处理系统。然而，作为一种新污染物，抗生素类不能被传统污水处理厂完全去除而遗留于污水处理厂的二级出水中[1-3]。环丙沙星（CIP）是一种全球广泛使用的广谱氟喹诺类抗生素，其在污水处理厂出水中的检出频率和浓度均呈现较高水平[3-5]。同时，CIP是对敏感水生生物呈现高生态风险的抗生素，低浓度条件下即可造成水生态系统和人体健康的较大负面影响[6]。

目前反硝化生物滤池是污水深度处理领域研究和应用的热点，可有效解决污水处理厂二级出水因NO3--N浓度过高而引起的总氮超标问题[7-8]。研究表明，尽管反硝化生物滤池系统的设计目的主要是为了高效去除硝态氮，然而其使抗生素的转化去除也同步得到了提升[9-11]。比如，在葡萄糖/乙酸钠-反硝化脱氮系统中，抗生素CIP均可被同步去除，去除率最高可达83%[9-10]。在甲醇/乙醇-后置反硝化生物滤池中，乙酰磺胺嘧啶和甲氧苄啶等抗生素的生物转化速率常数可以达到1.2～12.9 L/(g·d)（以生物量计）[11]。究其原因，有机碳源是生物滤池系统中限制反硝化过程的重要因素，碳源类型也会对反硝化微生物结构产生影响[12-13]。有机碳源不仅为硝酸盐的还原提供电子，而且为抗生素的共代谢提供底物，从而实现NO3--N和抗生素的同步去除。由此可见，有机碳源是反硝化生物滤池中抗生素被同步生物转化的关键因素。

目前反硝化生物滤池的有机碳源主要分为2类：传统液体和新型固相有机碳源。相较于传统液体碳源（如乙酸钠和葡萄糖等），聚羟基丁酸戊酸酯（PHBV）作为微生物胞内储能物质，具有优异的生物相容性。大量研究表明，PHBV反硝化生物滤池具有广阔的市场应用前景，可以有效处理含有高浓度NO3--N的污水[14]，如硝酸盐污染的地下水[15]、城镇污水处理厂二级出水[16-17]以及水产养殖废水[18]等。Sun等[19]证实了曝气PHBV生物滤池可以有效处理含有50 µg/L布洛芬和三氯生的含氮废水。Feng等[20]发现相较于PHBV生物滤池，PHBV/活性炭生物滤池可以更有效处理含有100 µg/L美托洛尔和双氯芬酸的硝态氮废水，这主要是由于活性炭的吸附作用所引起的。上述研究主要探究PHBV反硝化生物滤池处理含有药品和个人护理用品（PPCPs）的氮污染废水，为反硝化生物滤池处理新污染物提供了一定理论支撑。

本研究探讨PHBV反硝化生物滤池深度脱氮过程中，典型抗生素 CIP（0～1 000 µg/L）的去除特征及其影响因素，以期为抗生素在污水处理系统中的风险削减调控提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验装置

本试验所构建的PHBV反硝化生物滤池装置结构如图1所示。装置主体采用有机玻璃外覆黑色避光膜构建，以防止CIP光解。生物滤池内径为20 cm，高80 cm，基质填充高度为60 cm。其中，生物滤池填充基质分为上下2层：下层填充50 cm火山岩与PHBV颗粒（1 000 g）的均匀混合物，上层填充10 cm生物陶粒。火山岩购于河南郑州元泉环保净水材料厂，平均粒径为30～50 mm；PHBV颗粒购于宁波天安生物材料有限公司，为呈乳白色螺旋圆的柱状颗粒，平均粒径约为8～10 mm；生物陶粒购于江西萍乡紫金陶粒厂，平均粒径为3 mm。

图1 PHBV反硝化生物滤池装置示意Fig.1 Schematic diagram of PHBV supported denitrification biofilter

1.2 试验设计

参照以往研究[21]，PHBV反硝化生物滤池以上流式运行。依据城镇污水处理厂二级出水特征[22]，模拟废水主要由自来水添加NaNO3、KH2PO4配制而成。系统首先接种3 500 mg/L二沉池污泥（取自上海市松江区污水处理厂），内循环3 d后连续进水；当反应器出水NO3--N浓度连续15 d小于1 mg/L时，则视为反应器启动成功。随后，依据污水处理厂出水CIP浓度[3-5]，探究CIP浓度为0～1 000 µg/L运行条件下系统的出水水质。为使研究接近实际工程参数，本试验在自然室温下连续运行112 d（2020年9月29日——2021年1月18日），各阶段进水指标和运行参数如表1所示。

表1 PHBV反硝化生物滤池进水水质特征和运行条件Table 1 Influent characteristics and operation parameters in PHBV supported denitrification biofilter

1.3 试验分析方法

1.3.1 水质测试方法

试验过程中，每天定时采集生物滤池进出水。参照以往研究方法[18]，将水样通过0.45 µm滤膜过滤后进行水质分析。利用哈希便携水质分析仪（HQ-40d）测定水样的DO、pH、ORP；COD采用快速消解分光光度法测定；NO3--N、NO2--N以及NH4+-N浓度分别利用紫外分光光度法、N-（1-萘基）-乙二胺光度法以及纳氏试剂光度法测定。

根据二维荧光全光谱扫描结果，CIP有2个最大激发波长（Em)，分别在280和325 nm处[19]。根据发射光谱扫描结果，发射波长（Ex)为447 nm。因此，三维荧光（EEM）的Em范围设置为230～260 nm，Ex范围设置为250～550 nm，狭缝宽度设置为5 nm。CIP浓度采用HPLC-荧光检测器检测法测定，柱温为40 ℃；流动相为0.05 mol/L磷酸-乙腈(体积比为18∶82)，流速为 1.0 mL/min，进样量为 20 µL；荧光检测器Em为280 nm，Ex为450 nm。

1.3.2 微生物群落测试分析方法

在试验结束时，沿反应器纵向0～10、10～20、20～30、30～40、40～50以及50～60 cm处分别取足量填料样品（n=3）。其中，各层3个平行样品的生物膜经微生物DNA抽提后混合在一起，样品分别命名为a1～ a6。采用高通量测序技术对上述样品进行微生物群落结构特征分析。16S rDNA高通量测序文库的构建和基于Illumina MiSeq平台的测序由上海派森诺生物科技股份公司完成。其中，本试验PCR扩增选用细菌16S rDNA 基因的高度可变的V3～V4区特异性引物，主要包括338F(5’-ACTC CTACGGGAGGCAGCA-3’) 和 806R(5’-GGACTAC HVGGGTWTCTAAT-3’)。利用 TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit进行建库，并在Illumina MiSeq平台上利用MiSeq Reagent Kit V3(600cycles)进行2×250 bp的双端测序。同时采用Quantiy one、Canoco、Mothur等软件分析试验数据，开展基于高通量测序技术的微生物群落多样性研究。

Chao1指数在生态学中常用来估计物种总数（样本中所含OTU数），计算公式为：

式中：SChao1为估计的OTU数；Sobs为实际观测到的OTU数；n1为只含有1条序列的OTU数；n2为只含有2条序列的OTU数。

香农（Shannon）指数是用来估算样品中微生物多样性的指数，计算公式为：

式中：S为DGGE胶中条带数；Pi为第i条带灰度在该样品总灰度中的占比，%。

2 结果与讨论

2.1 出水基础指标变化特征

生物滤池中进出水DO浓度、ORP、pH以及COD的变化如图2所示。DO浓度是影响反硝化作用的重要因素，大多数反硝化菌是兼性厌氧菌，在缺氧的情况下利用硝酸盐作为最终的电子受体[23]。由图2（a）可知，运行期间平均进水DO浓度为7.08～11.46 mg/L，这是由于运行温度逐渐降低，从而导致水中饱和DO浓度升高。整体而言，出水DO浓度（1.87～3.20 mg/L）均低于进水。出水DO浓度的显著降低可能是由于系统中兼性微生物分解PHBV有机物，需要消耗部分氧气造成的。ORP反映水体的氧化还原性，ORP越高则氧化性愈强，反之则还原性越强。从图2（b）可以看出，出水ORP逐渐降低并低于-100 mV，说明该系统易于NO3--N的还原反应发生。其中，ORP的降低主要是由于氧气和NO3--N等氧化性物质的消耗以及有机物的生成等因素所造成的。

图2 进出水DO、ORP、pH以及COD变化特征Fig.2 Variation characteristics of effluent DO,ORP, pH and COD

由图2（c）可知，进出水pH在6.36～7.61波动。除阶段Ⅰ外，其余阶段出水pH均略低于进水，这主要是由PHBV的酸性中间降解产物造成的[24]。研究表明，PHBV反硝化生物滤池出水COD主要是由于PHBV中间降解产物与其消耗量间的平衡造成的[14]。由图2（d）可知，整体而言，阶段Ⅰ～Ⅵ出水COD平均值分别为 (25.98±13.85)、(59.28±27.34)、(49.58±17.08)、(23.71±9.23) 、(23.28±10.56) 、(19.95±7.65)mg/L。相较于阶段Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，阶段Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ出水COD呈现一定下降趋势。Chu等[15]研究发现，在以高分子聚合物PHBV/竹粉为载体的反应器中，初始阶段的出水溶解性有机碳（DOC）浓度在15.4～98.9 mg/L波动，后期随着反应器运行，出水DOC浓度逐渐降至10.5 mg/L以下，这与本研究出水COD变化趋势类似。研究表明，有机碳源是抗生素降解的关键因素。如乙酸可促进流化床生物膜反应器对CIP的去除，其生物转化速率常数约增加了55%[25]，而较高的易降解有机碳负荷是反硝化生物滤池呈现更高的反硝化和微污染物生物转化速率常数原因[26]。因此，系统COD的降低可能是导致阶段Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ中CIP去除率下降的原因。

2.2 CIP在PHBV反硝化生物滤池中的去除规律

PHBV反硝化生物滤池系统阶段Ⅵ（CIP浓度为 1 000 µg/L ）进出水的三维荧光特征如图3所示。由图3可知，相较于进水荧光峰，出水荧光峰面积和强度明显缩小，说明CIP在出水中的浓度明显降低，证实了PHBV反硝化生物滤池可以同步去除CIP。

图3 PHBV反硝化生物滤池系统的CIP三维荧光特征Fig.3 EEM characteristics of CIP influent and effluent in PHBV supported denitrification biofilter

采用HPLC对反应器进出水CIP浓度变化特征进行定量监测，结果如图4所示。由图4可知，当进水CIP浓度为100～300 µg/L时（阶段Ⅰ～Ⅳ，处于秋季），出水CIP去除率大于98%，表明PHBV反硝化系统可以有效去除低浓度的CIP。究其原因，PHBV会被水解发酵细菌降解生成溶解态有机物质（如3-羟基丁酸3HB，挥发性短链脂肪酸乙酸、丙酸、正丁酸以及异丁酸等）[20]。研究表明，葡萄糖、挥发性脂肪酸以及乙醇等碳源添加可以增强CIP的生物去除率[21]。因此，PHBV及其中间代谢有机产物，可成为降解CIP的共代谢物质。内在原因可能是共代谢有机碳源可以诱导参与抗生素等有毒物质特定降解酶的表达[22-23]，如细胞色素P450酶可以催化CIP发生加羟基、水解以及哌嗪环中的C-N脱乙基等降解反应[24]。当进水CIP浓度提升至500和1 000 µg/L 时（运行阶段Ⅴ～Ⅵ，处于冬季），出水CIP浓度分别为55～215和210～669 µg/L，平均值分别为（152.8±38.91）和（510.35±99.28）µg/L，平均去除率分别降至69%和49%。可见，在秋季（温度为3～19 ℃）条件下，PHBV反硝化生物滤池可以有效处理 300 µg/L 的 CIP；然而，冬季（温度为-8～12 ℃）条件下，PHBV反硝化生物滤池不能高效地处理较高浓度（1 000 µg/L）CIP。

图4 PHBV反硝化生物滤池系统进出水CIP浓度变化Fig.4 Variation of CIP concentrations in influent and effluent in PHBV supported denitrification biofilter

2.3 CIP对PHBV反硝化生物滤池脱氮效果的影响

2.3.1 NO3--N进出水变化规律

PHBV反硝化生物滤池进出水NO3--N浓度变化如图5所示。由图5可知，随着微生物的适应，阶段Ⅰ出水NO3--N浓度呈现逐渐下降趋势，但是阶段Ⅱ～Ⅵ出水NO3--N浓度呈波动变化趋势。随着HRT的提升（阶段Ⅱ），与前人研究结果类似[22]，出水NO3--N浓度明显下降并保持在稳定状态，出水NO3--N 平均浓度为（0.62±0.37）mg/L。当进水CIP浓度为100 µg/L时（阶段Ⅲ），出水NO3--N浓度并无明显改变，NO3--N平均去除率为97%±1%，说明低浓度CIP对PHBV反硝化生物滤池系统脱氮性能的抑制影响可以忽略不计。进水CIP浓度增至300µg/L时（阶段Ⅳ），出水NO3--N浓度明显上升并呈波动状态；其中出水NO3--N浓度为0.76～10.65 mg/L，平均值为（4.59±2.06）mg/L，NO3--N 平均去除率降为71%±14%。当进水CIP浓度进一步增至500和1 000 µg/L（阶段Ⅴ、Ⅵ）时，出水NO3--N浓度分别为1.17～7.92和2.97～9.45 mg/L，平均值分别为（5.15±2.56）和（6.13±1.80）mg/L；NO3--N 平均去除率分别降为68%±16%和60%±12%。由上述结果可知，冬季低温和高浓度 CIP（＞300 µg/L）条件下，脱氮效果受到了明显的抑制。

图5 PHBV反硝化生物滤池系统NO3- -N浓度变化Fig.5 Nitrate removal performance in PHBV supported denitrification biofilter

2.3.2 NH4+-N进出水变化规律

PHBV反硝化生物滤池进出水NH4+-N浓度变化如图6所示。由图6可知，相较于进水NH4+-N浓度，整个运行期间出水NH4+-N浓度均有不同程度的升高。其中，阶段Ⅰ～Ⅵ，出水NH4+-N平均浓度分别为（0.70±0.31）、（1.12±0.38）、（1.96±0.51）、（0.96±0.30）、（1.20±0.24）、（1.20±0.38）mg/L。这是由于系统发生了硝酸盐异化还原（DNRA）作用，即在微生物作用下将硝酸盐异化还原为铵的过程。研究证明在PHBV反硝化生物滤池深度脱氮过程中，当运行温度为30 ℃时，出水NH4+-N浓度呈现出一定程度的上升趋势；随着运行温度逐渐降至10 ℃，出水NH4+-N浓度均呈现下降趋势[27]，说明低温条件下DNRA受到了明显抑制作用。由此可以推断，CIP的加入有可能改变了氮的代谢途径，一定程度上增强了DNRA过程，从而导致低温条件下出水NH4+-N浓度升高。此外，系统进出水NO2--N浓度的变化特征表明，出水NO2--N浓度始终维持在较低水平，最高浓度为0.26 mg/L；整个运行阶段均无NO2--N的明显积累，可忽略不计。

图6 PHBV反硝化生物滤池系统各阶段进出水NH4+ -N浓度变化Fig.6 Concentration of NH4+ -N in influent and effluent during different phases in PHBV supported denitrification biofilter

2.3.3 反应器纵向沿程水质变化

阶段Ⅵ中，纵向沿程水质变化特征如表2所示。由表2可知，COD呈现2次先上升后下降趋势，与pH的变化呈明显的负相关，进一步佐证了PHBV降解产生了酸性有机产物。NO3--N和CIP纵向沿程浓度均呈现递减趋势，其中NO3--N沿程去除率分别为16%、28%、34%、42%、61%和72%；CIP沿程去除率分别为8%、15%、18%、39%和50%。40～50 cm沿程中NO3--N和CIP去除率最高，分别达到了20%和15%，这可能是由于该沿程中较高的COD累积为反硝化菌和CIP降解菌提供了充足的有机碳源。此外，NO2--N积累可忽略不计，NH4+-N浓度整体略有上升，进一步验证了低温条件下DNRA的发生。

表2 PHBV反硝化生物滤池纵向沿程水质变化特征Table 2 Characteristics of water quality along the longitudinal profile in PHBV supported denitrification biofilter

2.4 微生物群落结构特征

PHBV反硝化生物滤池系统的微生物多样性指数见表3。由表3可知，生物滤池系统中微生物多样性随着纵向沿程发生了明显的变化。样品a1～a6的Shannon指数为4.77～9.65，微生物群落多样高的位置集中在PHBV/火山岩填充层中，尤其是以样品a2（10～20 cm）和a5（40～50 cm）处较高。Chao1指数越大表示微生物群落的丰富度越高，生物滤池的Chao1指数为2 192.23～4 863.72，样品a2（10～20 cm）和 a5（40～50 cm）处的物种总数均高于生物滤池其他区域。整体而言，样品a6的Chao1指数和Shannon指数相较于生物滤池其他区域均是最低的，说明50～60 cm处物种丰富度和物种总数最低，这与系统纵向的水质变化特征以及基质种类（如有机/无机填料）等有密切关系。

表3 PHBV反硝化生物滤池系统的微生物多样性指数Table 3 Microbial diversity index of PHBV supported denitrification biofilter

PHBV反硝化生物滤池系统的微生物群落结构在门、纲及属水平上的组成如图7所示。由图7（a）可知，6个样品的优势菌门主要包括变形菌门（Proteobacteria）、类杆菌门（Bacteroidetes）以及厚壁菌门（Firmicutes）等。上述优势门的相对丰度均存在明显的差异，表明了PHBV反硝化生物滤池系统纵向空间微生物群落结构的差异性。整体而言，样品a1、a2、a4以及a5在门水平的组成相似性较高，a3和a6则呈现明显的差异性。6个样品中的最优势门均为Proteobacteria，其次为Bacteroidetes。大量研究表明，Proteobacteria是固相碳源反硝化脱氮系统中的最优势门[28-30]。Bacteroidetes的主要功能是实现有机物的水解发酵，其在样品a1～a5中均属于优势门，而在a6中的相对丰度可忽略不计。研究表明，PHBV作为一种高分子生物聚合物，可经水解发酵细菌降解微小分子有机物[24]。很明显，Bacteroidetes的丰度特征与该系统的PHBV有机基质分布特征存在明显的相关性。

由图7（b）可知，6个样品的优势菌纲包括γ变形菌纲（Gammaproteobacteria）、拟杆菌纲（Bacteroidia）以及α变形菌纲（Alphaproteobacteria）等。其中，Gammaproteobacteria为所有样品的最优势纲，相对丰度分别为63%、61%、39%、67%、56%以及92%。研究表明，Gammaproteobacteria能够在异生环境中降解和转化能被利用的有机物[31]，可良好分泌胞外聚合物（EPS），相对其他微生物可更有选择性地黏附在生物膜表面[32]。Gammaproteobacteria可能因对CIP具有较高的耐药性，从而成为系统的优势纲。

图7 门水平、纲水平以及属水平上微生物群落相对丰度Fig.7 Relative abundance of microbial communities at phylum, class and genus levels

由图7（c）可知，从属水平上看，系统中前10种优势菌包括气单胞菌属（Aeromonas）、脱氯单胞菌属（Dechloromonas）、硫氧化单胞菌属（Sulfurimonas）、SC-I-84、Lentimicrobiaceae、固氮螺菌属（Azospira）、[Eubacterium]_brachy_group、动胶菌属（Zoogloea）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）以及固氮卷菌属（Azonexus）。其中，样品a1的优势属为Sulfurimonas（11%）、Aeromonas（8%）以及Dechloromonas（8%）；样品 a2的优势属为Aeromonas（10%）、Dechloromonas（7%）；样品a3的优势属为Dechloromonas（7%）；样品a4的优势属为Aeromonas（41%）；样品a5的优势属为Dechloromonas（10%）和Aeromonas（6%）；样品 a6 的优势属为Aeromonas（83%）。Aeromonas对β-内酰胺酶基因相关的β-内酰胺类抗生素具有固有耐药性，Aeromonas的一些分离株也显示出对抗生素四环素的耐药性[33]。Dechloromonas是PHBV反硝化生物滤池深度脱氮过程中的优势反硝化菌属[21]，其在样品a1～a5中的相对丰度均超过了5%，最高达10%。据报道，Dechloromonas是外加乙酸为碳源的脱氮系统中最优势的反硝化菌属。当系统暴露于氟喹诺类抗生素（FQs）时，Dechloromonas可保持不变甚至呈增加的趋势，说明Dechloromonas对FQs具有良好的耐药性和适应性[32]。类似地，当FQs类抗生素洛美沙星浓度提升至500 ng/L，Dechloromonas和Brevundimonas将替代Ochrobactrum与Azospirillum而成为系统的优势菌属[34]。由此推测，Dechloromonas在系统中的优势存在，是系统暴露于CIP条件下依然保持较好脱氮能力的重要原因。除此之外，整个系统反硝化细菌种类丰富，主要包括Sulfurimonas[35]、Dechloromonas[36]、Azospira[37]、Zoogloea[38]、Azonexus[39]、Simplicispira[40]、Flavobacterium[41]、Thiobacillus[35]以及Hydrogenophaga[42]等。由此可见，尽管系统长期暴露于CIP，系统的反硝化菌属物种依然丰富，这可能是由于污水处理厂中反硝化菌属多携带抗性基因所导致的[43]。

3 结论

（1）秋季适宜温度（3～27 ℃）条件下，PHBV 反硝化生物滤池可实现同步高效去除进水15 mg/L NO3--N和300 µg/L CIP（均超过95%）；冬季低温（-8～12 ℃）条件下，PHBV反硝化生物滤池对于进水15 mg/L NO3--N和1 000 µg/L CIP的去除率分别为60%和49%。系统出水COD变化趋势和纵向沿程水质变化特征揭示了NO3--N和CIP的同步去除效果与COD呈现一定的正相关关系。

（2）微生物群落结构特征分析显示，虽然PHBV反硝化生物滤池长期暴露于微量CIP，但是系统的反硝化菌属物种依然丰富多样，主要包括Sulfurimonas、Dechloromonas、Azospira、Zoogloea、Azonexus以及Simplicispira等；其中最优势反硝化菌属Dechloromonas的相对丰度最高（达10%），推测其是PHBV反硝化生物滤池系统在CIP条件下依然保持较好脱氮能力的重要原因。