紫檀芪减轻小鼠肝窦内皮细胞氧化损伤的机制

姚 雷，蔡海建，刘 邓，陈立建，唐震海，都 建

(安徽医科大学 1.基础医学院、2.科研实验中心、3.第一附属医院麻醉科，安徽 合肥 230032)

肝脏缺血/再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)长期以来被认为是引起缺血性休克、肝切除和肝移植不良结果的主导因素[1]。缺血/再灌注损伤引起炎症因子积聚，加剧器官急性排斥反应发生，同时引起胆道并发症，致使移植物失功。在IRI的防治中，之前的研究重点是保护肝脏实质细胞，然而，最近的研究结果发现，肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells，LSECs)在早期再灌注过程中会出现功能和表型失调，并对邻近细胞和肝脏疾病病理生理学产生负面影响[2]。LSECs是肝脏内最丰富的非实质细胞，维持肝内微循环稳态发挥重要作用。LSECs形成肝窦壁，与其他毛细血管不同，它们缺乏有组织的基底膜，细胞质被开放的小孔穿透，使肝脏微血管内皮细胞不连续[3]，这种连接方式使得肝实质细胞与肝窦间物质交换更加便捷[4]；窗孔是一种动态结构，肝脏的病理生理改变都会影响窗孔的大小改变，调控肝脏微循环[5]。血红素加氧酶是催化血红素降解的限速步骤，产生胆红素、一氧化碳(CO)和铁离子[6]，分解产物具有抗炎、抗氧化、调节细胞周期、改善微循环等作用[7-8]，尤其在临床肝移植手术过程中，肝微循环在再灌注后的恢复极为重要。紫檀芪(pterostilbene，PTE)是从紫檀、蓝莓等植物提取的天然酚类化合物。近年来发现，PTE具有良好的抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性而被普遍关注[9-10]。由于其3、5位甲基化特殊结构，使其具备比其他酚类化合物，如白藜芦醇、白皮杉醇更高的生物利用度以及更强的稳定特性。有相关研究表明，PTE对肝脏缺血/再灌注损伤有保护作用[12]，然而对于LSECs保护及具体途径尚不清楚。本实验通过原代提取LSECs为细胞模型建立体外氧糖剥夺模型(oxygen-glucose-serum deprivation/reoxygenation，OGD/R)，研究PTE通过保护LSECs使肝脏免受缺血/再灌注损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料C57BL/6J小鼠(雄性，6-8周龄)购于河南斯克贝斯生物科技技术公司，动物生产许可证号：SCXK(豫)2020-0005。PTE(批号：41876)购于MCE公司；胎牛血清(批号：2203013)、链霉素(批号：2149393)均购于Vivacell公司；无糖培养基(批号：2323273)购于Gibco公司；ECM(批号：34356)完全培养基购于Sciencell公司；HO-1抗体(批号：KK1123)、HRP标记的山羊抗兔(批号：KK1116)、山羊抗鼠二抗(批号：KK0824)购于成都正能生物公司；β-actin(批号：10021787)购于武汉三鹰公司；AST(批号：20211027)及ALT(批号：20211028)检测试剂盒购于南京建成公司。

1.2 实验方法实验小鼠分为：假手术组、模型组(I/R组)、PTE处理组(10、20、40 mg·kg-1)。实验前1 d对上述分组小鼠12 h禁食处理。(1)假手术组：1%戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠，固定小鼠，于肋下缘与腹中线交点作纵向切口，裸露出第一肝门，眼科镊小心游离出门静脉和肝动脉，不夹闭肝叶供血，不进行任何其他处理，最后缝合腹腔。(2)肝缺血/再灌注损伤模型组(I/R)：1%戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠，固定小鼠，于肋下缘与腹中线交点作纵向切口，裸露出第一肝门，眼科镊小心游离出门静脉和肝动脉，止血夹夹闭肝中叶和左叶门静脉，夹闭0.5 min观察左叶和中叶同肝右叶对比明显变白，临时缝合腹腔创口，覆盖无菌纱布，立即将小鼠置于37 ℃恒温垫维持体温恒定。持续缺血60 min，拆除缝合线，快速取下止血夹，0.5 min肝脏缺血部分逐渐恢复正常颜色，缝合腹腔，再灌注6 h后摘取眼球收集血液样本，取肝脏样本。(3)PTE处理组(10、20、40 mg·kg-1)：肝缺血/再灌注前1 h，小鼠腹腔注射3种浓度的PTE，再灌注6 h后眼球取血，取肝脏样本。

1.3 LSECs原代细胞提取分组1%戊巴比妥钠注射麻醉小鼠，沿腹股沟中线开放腹腔，留置针穿刺门静脉，切开下腔静脉，使用37 ℃预热的0.5 mmol·L-1的EGTA灌流3 min，蠕动泵速率为60 r·min-1，换用37 ℃预热的消化液对肝脏再灌注5 min，蠕动泵速率为40 r·min-1，至肝脏松塌有裂痕。剪下肝脏放入纯培养基的平皿，撕碎让肝细胞流出，200目滤网过滤未消化的组织，分离肝窦内皮细胞使用Percoll梯度离心法和选择贴壁法纯化。LSECs分组为对照组、模型组、PTE处理组。对照组使用正常培养基培养，无任何处理；模型组做缺氧复氧处理；PTE处理组使用不同浓度PTE(10、20、40 μmol·L-1)预处理6 h，再进行缺氧复氧处理。

1.4 小鼠血清ALT/AST测定各实验组小鼠在手术完成后，使用眼科镊摘去眼球取血，37 ℃静置1.5 h，4 ℃(3 500 r·min-1，10 min) ，收取血清，按照检测试剂盒说明书操作，在405 nm测定吸光度，分别计算ALT/AST含量。

1.5 肝组织病理学检查小鼠肝脏缺血/再灌注后，离体分离在4%多聚甲醛固定。乙醇梯度脱水后包埋，苏木精伊红染色后封片，随机选择区域光学显微镜拍摄观察。

1.6 透射电镜观察肝窦内皮组织细胞根据上述方法分组，小鼠肝脏组织再灌注后，将肝脏标本分割成1 mm3，立即放入5%稀释浓度的戊二醛中固定，乙醇梯度脱水、块染、渗透和包埋处理，使用超薄切片机获得超薄切片，在透射电子显微镜(Talos L120C G2)观察。

1.7 扫描电镜观察窗肝窦内皮细胞窗孔按照上述分组，肝窦内皮原代细胞提取后接种于24孔板，孔板下覆盖14 mm细胞爬片，经缺氧复氧步骤处理，5%稀释浓度的戊二醛固定6 h，经乙醇梯度脱水后，K850型临界点干燥仪干燥，离子溅射仪涂上薄层金属，并在场发射扫描电子显微镜下(Gemini SEM 300)观察。

1.8 Western blot按照上述分组，原代细胞经体外缺氧复氧步骤在RIPA裂解缓冲液中制备全细胞裂解物，经恒压SDS凝胶电泳采用恒流湿转至硝酸纤维素转印膜，放于封闭液中常温封闭3 h。洗膜后常温一抗孵育2 h，漂洗后室温二抗于低速摇床上孵育1.5 h，通过化学发光成像系统获取图像。使用ImageJ软件定量。

2 结果

2.1 PTE处理对肝脏ALT、AST表达影响检测各组血清ALT和AST水平，由Fig 1可得出，I/R组ALT和AST水平明显上升髙(P<0.01)，同时PTE治疗组血清ALT和AST水平较I/R组明显降低(P<0.01)，说明PTE对小鼠肝脏有明显保护作用。

2.2 PTE处理对肝脏结构保护小鼠肝脏组织HE染色结果如Fig 2，假手术组(Fig 2A)肝细胞形态边界完整，无任何病理性改变；I/R组(Fig 2B)核固缩，出现严重坏死，病理损伤明显增加。经3种剂量的PTE治疗组(Fig 2C～E)显示出较小的肝细胞死亡区域，同I/R组相比坏死明显降低。

2.3 PTE处理对肝窦内皮细胞保护作用TEM观察肝脏各组超微结构(Fig 3)，假手术组：肝窦内皮细胞绕肝窦腔排列，呈扁平状，可明显观察到大量的开放的开窗结构，内皮下膜薄，缺乏有组织的基底膜，腔内胶原纤维较少；I/R组：窗孔数量同假手术组相比，明显减少，内皮下胞膜增生变厚，出现连续基底膜；PTE预处理组：窗孔开放数量明显增多。

Fig 1 Changes in serum ALT and AST levels in mice A：Serum ALT level;B：Serum AST level;CON：Control group;I/R：Model group;PTE-10：Pterostilbene 10 mg·kg-1 treatment group;PTE-20：Pterostilbene 20 mg·kg-1 treatment group;PTE-40：Pterostilbene 40 mg·kg-1 treatment group;##P<0.01 vs CON group;**P<0.01 vs I/R group.

2.4 PTE处理对肝窦内皮细胞窗孔的影响肝窦内皮原代细胞SEM检测(Fig 4)，结果显示：在正常肝窦内皮细胞中，具有明显的窗孔结构，窗孔开放；I/R组细胞窗孔明显减少；PTE处理组窗孔数量同I/R组相比，有明显增加。表明PTE可改善缺血/再灌注后肝窦内皮细胞窗孔开放，有利于肝脏微循环恢复，减轻肝脏缺血/再灌注损伤。

Fig 2 Hetopathological HE staining of liver in various groups of miceA：Sham group;B：I/R group;C：Pterostilbene 10 mg·kg-1 treatment group;D：Pterostilbene 20 mg·kg-1 treatment group;E：Pterostilbene 40 mg·kg-1 treatment group.

Fig 3 Effects of pterostilbene on liver tissue in various groups of mice observed by transmission electron microscopy (TEM)A：Liver tissue in the sham group;B：Liver tissue in the I/R model group;C：Pterostilbene treatment group.E：endothelial cells，H：hepatocytes，V：villi，F：fenestrae，S：blood sinuses

Fig 4 Effects of pterostilbene on fenestrae of liver sinusoidal endothelial cells in each group of mice observed by scanning electron microscopyA：Liver sinusoidal cells of normal mice;B：Liver sinusoidal endothelial cells of model group;C：Liver sinusoidal endothelial cells of pterostilbene treatment group.

2.5 PTE处理对肝窦内皮细胞一氧化氮合酶蛋白表达影响同对照组相比(Fig 5)，OGD/R后HO-1蛋白表达明显下降(P<0.01)，经过PTE预处理后，HO-1表达水平明显上调(P<0.01)。

3 讨论

PTE从蓝莓浆果中提取，属于天然结构化合物，具有抗炎、抗氧化作用。PTE能通过上调 PINK1介导的线粒体自噬在肝脏I/R损伤中发挥保护作用；并且还可以降低TNF-α、IL-1β和NF-κB的表达，减轻急性肝损伤诱导的组织损伤、炎症反应[12]。在前期研究中，通过体内实验建立70%肝脏缺血/再灌注(缺血60 min)模型，也证实了PTE处理显著降低血清中ALT、AST表达，减少肝脏缺血/再灌注后的组织水肿坏死。但这都是在肝实质细胞中讨论，对于非实质细胞还没有具体研究。

Fig 5 Effects of pterostilbene on HO-1 protein expression levels of liver sinusoidal endothelial cells in various groups A：Western blot detected the expression level of HO-1;B：HO-1 protein semi-quantitative analysis;1：Control group;2：OGD/R group;3：Perostilbene 10 μmol·L-1 treatment group;4：Pterostilbene 20 μmol·L-1 treatment group;5：Pterostilbene 40 μmol·L-1 treatment group;##P<0.01 vs Control group;**P<0.01 vs OGD/R group

肝脏70%非实质细胞为LSECs，与其他血管内皮细胞的形态和功能不同，LSECs沿窦壁排列呈扁平状，细胞边界清晰，存在典型的窗孔结构。缺乏基底膜，没有隔膜，从而使肝脏微血管内皮不连续[13]。最新研究发现，LSECs在IRI期间迅速去分化，获得血管收缩、促炎和促血栓特性，这一过程被称为“毛细血管化”，窗孔和基膜沉积的缺失阻碍了肝细胞的适当氧化，ATP供应减少，物质运输障碍，最终导致损伤相关分子模式(DAMP)的分泌[14]。本研究在体内实验通过TEM观察发现，缺血/再灌注后LSECs窗孔数量明显减少，内皮下胞膜增生变厚，出现连续基底膜。而当PTE预处理后窗孔开放数量显著增多。为进一步证实这种现象，体外实验通过差速离心法分离原代LSECs，并采用氧-葡萄糖剥夺再恢复(OGD/R)构建肝缺血/再灌注模型。SEM显示，正常组LSECs窗孔数较多，缺氧后窗口数减少；与模型组相比，PTE治疗组LSECs窗口数显著增加。这些证据说明肝脏I/R期间，PTE对于LSECs窗孔结构的完整性具有很好的保护作用，进而维持肝脏的微循环，保证能量供应和物质运输。

HO-1是催化血红素降解限速酶，是炎症细胞和组织损伤的关键介质，通过减轻氧化应激损伤，调节细胞周期以及改善微循环发挥有益作用。有相关研究表明通过上调HO-1可以减轻LSECs中的缺血性损伤[15]。本课题组发现，PTE能够诱导OGD/R后LSECs内HO-1表达，降低LSECs缺氧-复氧损伤。

综上所述，PTE通过保护LSECs的结构和功能减轻肝脏免受缺血/再灌注损伤。该过程中，PTE通过保护LSECs窗孔结构的完整性，上调HO-1蛋白表达水平发挥重要作用。因此，本研究为PTE保护肝脏免受缺血性损伤提供了新的理论依据。