云南江城雪茄烟根结线虫病的病原鉴定及生物源氨气熏蒸的防治效果研究

马桂妹，谭 涛，杨 东，刘 通，莫明和，王 扬，姜方荣，张应和，赵 华，刘剑金**

(1.云南大学 省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650091；2.云南省烟草公司普洱市公司，云南 普洱 665000；3.云南农业大学省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，云南 昆明 650201)

由根结线虫（Meloidogynespp.）侵染引起的根结线虫病是多种作物的重要土传病害.全球报道的根结线虫种类有90余种，在中国分布的有50余种，其中危害最重的有4种：南方根结线虫（M.incognita）、北方根结线虫（M.hapla）、花生根结线虫（M.arenaria）和爪哇根结线虫（M.javanica）[1].全世界每年因根结线虫造成的烟草产量损失估计为15%[2].根结线虫病是中国烤烟种植中的重要病害之一，目前，烟草根结线虫病除东北烟区发病较轻外，在其他16个产烟省区均有严重危害的发生报道，每年造成烟草经济损失约有 6 000万元[3].危害中国烤烟的根结线虫种类主要为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫和象耳豆根结线虫.其中，南方根结线虫为中国大多数烟区的优势种，分布广泛；花生根结线虫和爪哇根结线虫为区域性的优势种[4].

雪茄烟是一种用原料烟叶经过晾干、发酵、陈化等处理制作而成的特殊烟制品，具有雪茄香型、香气浓郁、吃味浓、劲头大、烟气呈碱性、焦油与烟碱比值小的烟质特点[5].雪茄烟叶主要在古巴、印度尼西亚、美国、多米尼加、洪都拉斯、巴西、墨西哥、牙买加和尼加拉瓜等国广泛种植.据统计，2015年上半年，中国卷烟生产与销售量分别下降3.11%和2.23%，但中国雪茄烟却逆势上涨，产量增长37.2%，销量增长82%，销售额增长55.4%，雪茄烟已成为中国烟草行业新的经济增长点[6].制作雪茄的烟叶按其在产品中的用途可分为茄衣、茄套和茄芯，国内也习惯称作外包皮、内包皮和芯叶.优质的雪茄烟叶是制作高品质雪茄的基础，目前国产优质雪茄烟叶严重匮乏，茄衣和茄套全部依靠进口.近年来，中国引进多种雪茄烟叶品种，在海南、四川、湖北和云南等省大面积试种，中国特色的雪茄烟产业正在逐步形成[7].云南省普洱市具有种植雪茄烟叶的优良地理气候条件，土壤以沙粒和粘粒为主，是中国发展优质雪茄原料最具潜在优势的产区之一.云南省烟草公司普洱市公司2019—2022年在江城县、宁洱县等地共开发种植雪茄烟叶约208 hm2(3 120余亩)，均不同程度地发生根结线虫病.由于种植茄衣品种需要搭建遮阴网棚，投入成本较高，往往会在同一块土地上连作多年，导致根结线虫病逐年加重，根结线虫病很有可能成为阻碍普洱烟区雪茄烟叶产业可持续发展的重要病害之一.然而，目前国内外对雪茄烟叶根结线虫病的病原鉴定、种类组成、病理流行规律等研究未见报道.

“生物熏蒸（biofumigation）”一词最早出现在利用十字花科（Brassicaceae）植物熏蒸土壤进而抑制土传病害的研究中，十字花科植物中的芥子油甙在芥子酶的催化下水解并释放出抑制病原菌的异硫氰酸酯类化合物，对控制土传病害有良好防效[8].利用各种植物废弃物产生的挥发性物质熏蒸土壤已被证明对根结线虫病具有良好的防效，并在很多国家广泛推广应用[9].氨气（NH3）对多种植物病原线虫具有高效杀灭活性.利用NH4OH、(NH4)2HPO4、NH4HCO3等能释放NH3的肥料熏蒸土壤能有效防治根结线虫病[10]；熟石灰与鸡粪等有机物混合使用时释放的NH3能有效控制根结线虫病害[11].脲酶可专一性催化尿素产生NH3，利用细菌脲酶催化尿素释放NH3被证明对根结线虫病具有良好防效[12].一些食用菌菌渣含有丰富的脲酶[13].据此，本文提出利用菌渣脲酶催化尿素释放NH3防控根结线虫病的新策略，并在此研究中评估该策略的可行性和实效性.

1 材料与方法

1.1 雪茄烟叶根结线虫病的根样采集及病害程度调查2021年7月13日，在云南省普洱市江城县整董镇整董村13.33 hm2(200余亩)连片种植的雪茄烟叶大田（经纬度：101°55'84″E, 22°43'6″N；海拔：813 m；品种：云雪1号），采用五点取样法拔出烟根，100株/点，共500株，取样点覆盖面积约6.67 hm2(100亩).洗净根系附着土壤，带回实验室，按5级标准进行根瘤分级并计算病情指数和病株率[14].病情指数=100×Σ（各级病根数×各级代表值）/（调查总根数×最高级代表值）.病株率（%）=感病株数/调查总株数×100%.

1.2 根结线虫病原鉴定

1.2.1 雌虫会阴花纹形态鉴定 从感病烟株根瘤上挑取雌虫，参照文献[15]描述的方法制作根结线虫雌成虫会阴花纹，在显微镜下观察会阴花纹的形态特征并拍照.

1.2.2 根结线虫的分子鉴定 从感病烟株根瘤上挑取成熟的单头雌虫，放于装有5 μL无菌ddH2O的PCR管中，参照文献[16]方法提取线虫DNA.根据雌虫会阴花纹形态，初步判断此线虫为爪哇根结线虫（M.javanica）.因此，以线虫DNA为模板，选用爪哇根结线虫特异性引物（Fjav/Rjav）进行SCAR-PCR.PCR反 应 体 系(50 μL)：5×Trans Start® Fastpfu Buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，Trans Start®DNA polymerase 1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，线虫DNA模板2 μL，无菌ddH2O 31 μL.扩增条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，35个循环；循环结束后72 ℃延伸10 min，PCR产物于1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测.

1.3 科赫法则验证病原线虫的致病性从田间采集的感病雪茄烟叶根样上挑取卵块，置于培养皿的筛网上.在培养皿中加入适量的无菌水，25 ℃下孵育7 d后用贝曼漏斗法分离并离心浓缩，获得二龄幼虫（J2）悬液（约2 000条/mL）.将烟用育苗基质在高温高压（121 ℃、110 kPa）下湿热灭菌1 h后装盘，播种雪茄烟叶“云雪1号”种子，在温室条件下按烟草常规育苗方法获得5叶期烟苗.在花盆中装入经高温高压湿热灭菌的土壤，移栽烟苗，1株/盆，移栽5 d后接种J2悬液0.5 mL/株，以等体积无菌水替代J2悬液接种为对照，每处理10个重复.在温室内培养60 d时拔出烟株，挑取雌虫并按上述方法进行会阴花纹的形态比对和分子鉴定.

1.4 食 用 菌 菌 渣 脲 酶 活 性 的 测 定金针菇菌渣、杏鲍菇菌渣、香菇菌渣、姬菇菌渣取自云南省的陆良爨乡绿圆菇业有限公司，参照文献[17]方法测定菌渣的脲酶活性.脲酶活性用反应24 h时单位质量菌渣中含NH3-N的质量表示，单位为mg/g.

1.5 NH3致死J2的有效质量浓度测定在二分隔培养皿的其中一隔中倒上水琼脂培养基，并在培养基上接种雪茄烟叶根结线虫J2悬液0.5 mL.在另一隔中放入灭菌脱脂棉球，在棉球上滴加不同剂量的氨水（有效成分28%，分析纯，武汉制氨厂），立即用氨气测定仪（型号：GT-903，深圳市科尔诺电子科技有限公司）测定培养皿中的NH3质量浓度.熏蒸24 h时，用适量无菌水漂浮培养基上的J2，在解剖镜下计数J2死亡数（线虫僵直视为死亡），计算J2死亡率，以确定致死100% J2所需的NH3质量浓度.

1.6 盆栽试验基于上一实验，确定了致死100%J2所需的NH3最低质量浓度为136.8 mg/m3.通过预实验，确定了释放的NH3质量浓度≥136.8 mg/m3时菌渣、尿素、土壤的适宜配比和反应条件为：用尿素含量为4%的菌渣与土壤按质量比为1∶18的比例混合均匀，在w(H2O)≥60%、温度≥20 ℃条件下放置24 h.按此配比设置了盆栽试验的8个处理（表1）：在花盆中装入各种混料2 kg，然后加入J2稀释液1 L（含J2约2 000条）使混料水分质量分数在60%左右，用塑料膜密闭整个花盆，在28 ℃下放置3 d时测定各处理的NH3质量浓度，然后揭膜、放置1 d以挥发掉残余的NH3；然后移栽5叶期的雪茄烟烟苗.以经过灭菌使脲酶活性丧失的菌渣替代未灭菌菌渣为阳性对照，以未添加菌渣和尿素的处理为阴性对照，每处理10个重复.在温室内栽培90 d时，拔出烟根，进行根瘤分级，计算病情指数的防效.防效（%）=(1-x/y)×100%，x、y分别代表处理和阴性对照的病情指数.

表1 “菌渣+尿素”熏蒸土壤对雪茄烟叶根结线虫病的防治效果Tab.1 Control effects of fumigated soil with spent mushroom substrate plus urea on root-knot nematode disease of cigar tobacco

2 结果与分析

2.1 雪茄烟叶根结线虫病的病害严重度及症状在云南省普洱市江城县整董镇整董村约13.33 hm2（200余亩）连片种植的雪茄烟叶“云雪1号”大田中，平均烟株发病率为82.45%，病情指数为46.32，根结线虫病为重度发生.症状表现为：在轻度感染的烟株根系上形成大量大小不等的球状瘤结，根系完整[图1（a）]；在重度感染的烟株上，主根畸形，甚至腐烂，侧根不发达，形成大量小瘤结[图1（b）].地上部在烟叶旺长期前症状不明显，采收期时叶片稍变黄，长势衰弱，呈缺水缺肥状[图1（c）].

2.2 雪茄烟叶根结线虫病的病原鉴定随机挑取雌虫、雄虫、二龄幼虫各30条，用于形态特征数据的测量和形态描述.雌虫呈乳白色至棕黄色，梨形，具有长形渐尖的颈部，颈部位于纵向的体中轴线上[图2（a）]，体长527.5～812.7 μm，口针长14.3～17.6 μm，背食道腺开口到口针基部球的距离为2.1～3.4 μm.会阴花纹背弓圆而扁平，线纹平滑至波浪状，侧线清楚地将花纹的背线和腹线分开，分为明显的背区和腹区，无线纹通过侧线[图2（b）].雄虫体长747.6～131.4 μm，口针长18.5～24.1 μm，背食道腺开口到口针基部球的距离为3.3～5.4 μm，引带长6.9～9.7 μm.二龄幼虫[图2（c）]体长397.4～564.2 μm，口针长8.9～11.7 μm，尾长 46.8～59.7 μm.根据以上形态特征，参考根结线虫鉴定专著[1,18]，将侵染雪茄烟叶的根结线虫初步鉴定为爪哇根结线虫（M.javanica）.利用爪哇根结线虫特异性引物（Fjav/Rjav）扩增单条雌虫基因组DNA，获大小为720 bp的爪哇根结线虫特异性条带[图2（d）][16]，表明侵染雪茄烟叶的根结线虫为爪哇根结线虫.

图1 雪茄烟叶根结线虫病危害症状Fig.1 Symptoms of root-knot nematode disease on cigar tobacco leaf

图2 雪茄烟爪哇根结线虫形态及分子鉴定特征Fig.2 Morphological and molecular characteristics of Meloidogyne javanica from infected cigar tobacco

2.3 爪哇根结线虫是雪茄烟叶根结线虫病病原的科赫法则验证温室条件下，将分离自雪茄烟叶感病根系上的J2接种在“云雪1号”幼苗上.第4天时，通过染色发现根系内开始有J2的侵入[图3（a）]，接种30 d时，根系上线虫30～50个根瘤[图3（b），（d）]，地上部叶片开始退绿变黄[图3（c）]，表现出典型的根结线虫病症状.接种60 d时，通过检测根瘤上雌虫的会阴花纹形态和分子鉴定[图2（d）]，确定病原线虫为爪哇根结线虫.在未接种J2的对照中，植株长势正常，根系上无根瘤[图3（e），（f）].据此，确定爪哇根结线虫为雪茄烟叶根结线虫病的病原.

图3 科赫法则确定雪茄烟叶根结线虫病病原Fig.3 Koch's rule to determine the pathogen nematodein cigar tobacco

2.4 生物源NH3熏蒸土壤防治雪茄烟叶根结线虫病的效果采用二分隔平皿法测定了氨水释放不同质量浓度NH3对J2的致死活性，发现致死100%J2所需的NH3最低质量浓度为136.8 mg/m3.金针菇菌渣、杏鲍菇菌渣、香菇菌渣、姬菇菌渣中的脲酶活性分别为0.81、0.49、0.24 mg/g和0.17 mg/g.在这4种菌渣中加入尿素，在w(H2O)≥60%、温度≥20 ℃条件下放置24 h，菌渣中的脲酶均能催化尿素而释放NH3.在这4种烘干至恒重的菌渣中，当尿素质量分数为4%以上时，在w(H2O)≥60%、温度≥20 ℃条件下放置24 h，释放的NH3质量浓度均大于136.8 mg/m3.将含4%尿素的4种菌渣与土壤按质量比为1∶18的比例混合，在w(H2O)≥60%、温度≥20 ℃条件下放置48 h，释放的NH3最高质量浓度能达到136.8 mg/m3.测试了4种食用菌菌渣与尿素配合使用对雪茄烟叶根结线虫病的防治效果.结果（表1）显示，在相同施用剂量下，菌渣脲酶催化尿素在土壤中释放的NH3质量浓度在130.9（姬菇菌渣+尿素处理组）～218.7 mg/m3（金针菇菌渣处理组），各处理间的NH3质量浓度差异显著.在灭菌菌渣与尿素配合使用时，各处理中仅检测到很低的NH3质量浓度（11.6～12.5 mg/m3），未施用菌渣和尿素的空白对照中，NH3质量浓度最低（2.5 mg/m3），显著低于其它处理.“菌渣+尿素”熏蒸土壤对雪茄烟叶根结线虫病的防治在75.5%（姬菇菌渣+尿素处理组）～92.3%（金针菇菌渣处理组），各处理间的防效差异显著.“灭菌菌渣+尿素”的各处理对根结线虫病也表现出较低的防效，但显著低于“未灭菌菌渣+尿素”的以上各处理，防效在21.5%（灭菌香菇菌渣+尿素）～38.5%（灭菌姬菇菌渣+尿素）之间.

3 讨论

在世界范围内，危害烤烟的根结线虫种类主要包括南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫[19].在中国，烟草根结线虫的种类主要包括南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫和象耳豆根结线虫（M.enterolobii）.其中，南方根结线虫为中国大多数烟区的优势种，分布广泛；花生根结线虫和爪哇根结线虫为区域性的优势种[4].相对于烤烟，目前对雪茄烟病害的病原鉴定、病理流行、品种抗性、防控措施等方面的研究稍显薄弱.夏长剑等[20]系统调查了海南省2018—2019年间雪茄烟叶病虫害的种类，共报道了18种病害、7种虫害；其中包括根结线虫病，并指出海南雪茄烟根结线虫病为南方根结线虫（M.incognita）和爪哇根结线虫（M.javanica）混合发生所致，但未给出两种病原线虫的鉴定特征.本研究基于雌虫、雄虫和二龄幼虫的形态特征、PCR扩增特异性条带及科赫法则验证结果，将普洱市江城县雪茄烟叶“云雪1号”品种上发生的根结线虫病病原鉴定为爪哇根结线虫（M.javanica），首次明确了云南省内一种雪茄烟病原线虫的种类.当然，随着调查区域和栽培品种的扩大，不排除云南雪茄烟上有其它种类的根结线虫侵染，甚至多种病原线虫复合危害的现象存在.

雪茄烟叶适宜在温度适宜、光照充足、雨量充沛、红壤土至沙壤土、土壤矿物质丰富的烟区种植[21]，这样的气候和土壤条件特别适合根结线虫的生长、繁殖和侵染.随着中国雪茄烟叶种植面积的扩大以及连作年限的加长，根结线虫病极有可能成为雪茄烟叶种植中的头号重要病害，尽早开展该病害的防控研究刻不容缓.施用化学杀线虫剂是防控烟草根结线虫病的主要措施.目前，防治线虫病的药剂有30多种，常用的有10多种，主要分为熏蒸性药剂以及非熏蒸性药剂.由于常年滥用化学杀线虫剂，环境污染、线虫耐药性增强等问题逐渐显现，安全、有效的绿色防控措施备受青睐[22-23].自从广泛使用的化学熏蒸剂溴甲烷因破坏臭氧层被禁用之后[24]，农业生产中急需溴甲烷替代品及相应的熏蒸技术.氨水是能够释放NH3的高氮无机物，对真菌、细菌、线虫等土传病害病原有广谱抑制作用.利用氨水消毒茶园土壤对根结线虫病的防效达20%～77.83%[25]；氨水消毒土壤能有效控制香蕉枯萎病[26].利用能释放NH3的碳酸氢铵等无机氮肥开发的土壤熏蒸策略广泛应用于各种植物寄生线虫的防治[10,27]；但只有高浓度的NH3（152 μg·m-3）能抑制根结线虫的繁殖及瘤结的形成，相反低浓度的NH3（76 μg·m-3）能促进根结线虫的繁殖[28]，所以选择适宜的NH3浓度非常关键.中国食用菌产业每年产生的菌渣量约1.32亿t[29]，菌渣中含量丰富的脲酶为利用生物源脲酶催化尿素释放NH3防治根结线虫病提供了可能，然而，相关研究未见报道.本研究表明4种食用菌（金针菇、杏鲍菇、香菇、姬菇）菌渣脲酶催化尿素释放氨气熏蒸土壤对雪茄烟叶根结线虫病有良好的防治效果，防效在75.5%～92.3%，并明确了“尿素-菌渣-土壤”之间的配比和熏蒸条件.研究结果在利用生物源脲酶催化尿素防控根结线虫病害方面具有理论指导价值和应用价值，也为菌渣资源的循环利用提供了新途径.