基于入血成分和网络药理学探讨降香治疗急性心肌梗死的潜在机制

李宗超，孙 康，汪旻峻，迟呈林，王 炜*，刘荣霞*

1.烟台大学药学院，新型制剂与生物技术药物研究山东省高校协同创新中心、分子药理和药物评价教育部重点实验室，山东 烟台 264005；2.湖南中医药大学药学院，湖南 长沙 410208

急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）是由于冠状动脉急剧性供血不足导致的心肌坏死，是冠心病中危害性严重的一类病症[1]。 我国AMI 病人超百万，且发病率、死亡率呈快速上升趋势，是威胁人类生命健康安全的重大隐患[2]。 降香是豆科植物降香檀Dalbergia odorifera T. Chen 树干和根的干燥心材，收载于2020 版《中华人民共和国药典》，其味辛、性温，具有化瘀止血、理气止痛的功效，具有较高的医药价值[3]。 现代研究表明，降香有抗炎、抗氧化等众多药理作用，可用于治疗心血管疾病[4]。 降香提取物可改善心肌梗死大鼠的心功能障碍，其复方制剂如冠心Ⅱ号方、降香通脉汤等对AMI 也具有较好的临床治疗效果[5-7]。

网络药理学是一种基于系统生物学，通过构建“成分-靶点-通路-疾病”网络，从整体的角度阐述药物与疾病相互作用机制并挖掘药效物质基础的学科，适用于中药多靶点、多成分治疗的特点[8]。 从中药有效性角度来讲，需先明确从药材成分到入血成分的传递-转化过程，才能挖掘中药药效物质基础[9]。然而，在以往的网络药理学研究中，多采用数据库搜索中药成分，不能保证选出的成分是可以吸收入血的物质，从而无法保证这些成分的有效性。 因此，本文在课题组前期对降香的植物化学成分系统性分析的基础上[10]，对降香的入血成进行表征，再采取网络药理学的方法，构建“入血成分-靶点-通路-疾病”网络，系统分析降香治疗AMI 的药效成分及作用机制，并通过分子对接对其中的关键靶点与关键成分进行验证。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

HB 10 旋转蒸发仪（德国IKA 集团）；Waters Acquity H-class UPLC 系统（美国Waters 公司）；QExactiveTMOrbitrap HRMS 系统（美国Thermo Fisher Scientific 公司）。

乙酸、乙腈（色谱级，美国Merck 公司）；0.5%CMC-Na 溶液自制。

1.2 降香给药溶液制备

降香购自北京同仁堂，粉碎过40 目筛。 称取药材粉末加入10 倍量的95%乙醇浸泡过夜，加热回流提取1 h（重复3 次）。 将滤液合并，真空旋蒸得降香提取物粉末，用0.5% CMC-Na 溶液重悬。

1.3 动物与给药方案

6 只雄性SPF 级SD 大鼠，体质量（220±20） g，由济南鹏悦实验动物饲养有限公司提供，生产许可证号：SCXK（鲁）2019-0003。 大鼠饲养于舒适环境中，动物实验经烟台大学动物伦理委员会批准（2021-DA-04），实验过程遵守《实验动物管理条例》相关指南。实验设置空白组与给药组，给药组灌胃剂量根据降香生药临床用量每人每日15 g[3]，通过体表面积法折算为降香醇提物320 mg/kg，空白组给予相同体积生理盐水。

1.4 血清样本的制备与处理

参考相关文献[11-12]，分别在给药前及给药后0.25、0.5、1、2、4 h 于眼眶静脉取血，3500 r/min 离心10 min，离心半径8.6 cm，得血清样本。 取200 μL血清，并加入800 μL 冰乙腈，涡旋1 min，并于12 000 r/min离心10 min，离心半径8.6 cm。取上清液用氮气吹干，加入100 μL 初始流动相涡旋复溶，12 000 r/min离心10 min，离心半径8.6 cm，取上清液进样分析。

1.5 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 分析

色 谱 条 件：Waters Acquity UPLC HSS T3 柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样量5 μL。 流动相为0.05%乙酸水（A）、乙腈（B）。设置洗脱条件为0～19 min，17%～23%B；19～26 min，23%～25% B；26～36 min，25～40% B；36～41 min，40%～60% B；41～42 min，60%～90% B；42～44 min，90% B。

质谱条件：在负离子模式下采用HESI 源通过Full MS/dd-MS2方式扫描。 扫描范围50～800 m/z，喷雾电压选择-2.8 kV，离子源温度设置350 ℃，辅助气和吹扫气流速分别为10 L/min 和0 L/min，归一化碰撞能量分别为20、40、60 eV。

1.6 靶点的获取

在TCMSP 数据库和SwissTargetPrediction 数据库中查找入血成分靶点。 以“acute myocardial infarction”为检索词在GeneCards、OMIM 数据库获取AMI的靶点。 在Genecards 数据库中，Score 值高的靶点与疾病相关度高，因此，保留Score 值在中位数以上的靶点[13]。 合并数据库搜索结果，删除冗余条目，得成分与疾病的靶点。

1.7 PPI 网络的构建与关键靶点的筛选

将成分和疾病的共有靶点导入STRING 11.5数据库获取PPI 网络文件，并进一步通过Cytoscape 3.7.0 软件分析网络拓扑参数。Degree 反应节点与节点之间的相互联系，Degree 值越大的节点其重要性越高。因此，关键靶点以2 倍Degree 值中位数为标准筛选。

1.8 通路富集与网络构建

利用DAVID 6.8 数据库对关键靶点进行富集分析，以P＜0.01 为筛选条件。 基于上述结果，通过Cytoscape 3.7.0 软件构建“入血成分-靶点-通路-疾病”网络。

1.9 分子对接

选择PPI 网络中Degree 值排名前6 的关键靶点与关键成分进行分子对接验证。 通过在线数据库搜索成分与靶标蛋白晶体结构，导入Sybyl-X 2.1.1软件进行分子对接，以对接分值评价对接结合活性，分值越高表明对接活性越好。

2 结果

2.1 入血成分的鉴定

在降香提取物入血样品总离子流图中（图1），对前期降香定性研究得到的成分进行搜索，对比空白血清、给药血清与降香提取物质谱数据，根据保留时间、一级质量数和二级质谱数据，共鉴定出24 个降香入血成分（表1），包含异黄酮8 个、新黄酮4个、二氢异黄酮4 个、二氢黄酮3 个、查尔酮2 个、黄酮醇1 个、二氢异黄酮醇1 个、有机酸1 个。

表1 降香入血成分信息

图1 降香提取物入血样品总离子流图

2.2 关键靶点与成分

通过检索，获得入血成分靶点516 个，疾病靶点1812 个，其中共有靶点248 个。 在PPI 网络（图2）中，根据条件筛选出56 个关键靶点。 而染料木素（genistein）、山柰酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）、甘草素（liquiritigenin）、大豆苷元（daidzein）、芒柄花黄素（formononetin）6 个成分连接关键靶点最多，可能在降香治疗AMI 过程中起重要作用。

图2 PPI 网络图

2.3 富集分析

富集结果按P 值排序，分别将富集排名靠前的通路可视化。GO 功能富集（图3）显示降香主要参与调节受体结合、激酶活性等分子功能，胞质溶胶、血小板颗粒管腔等细胞组分，以及凋亡过程、蛋白激酶等生物过程。KEGG 富集（图4）通路中，与AMI 相关的有PI3K/AKT 信号通路、HIF-1 信号通路、FOXO信号通路等。

图3 GO 富集分析图（排名前10）

图4 KEGG 富集分析图（排名前20）

2.4 复合网络的构建

将筛选的关键靶点及其对应的成分、前20 条相关通路导入Cytoscape 软件，构建“入血成分-靶点-通路-疾病”复合网络（图5）。 该网络图包含101 个节点、820 条边。

图5 “入血成分-靶点-通路-疾病”网络图

2.5 对接结果

根据相关文献，对接分值在4.25 以上则表明成分与靶蛋白具有对接活性[14]。 对接结果（表2）显示，活性成分与关键靶蛋白大部分具有结合活性，其中SRC、EGFR 与各成分的对接活性最好，表明其潜在活性相对较高。每个靶点选择与其对接分值最高的成分进行可视化（图6）。

图6 成分与靶蛋白分子对接图

表2 分子对接结果

3 讨论

AMI 是由于冠状动脉闭塞、心肌急剧缺血缺氧导致的心肌组织坏死。 粥样斑块内部炎症浸润，以及缺氧导致的氧化应激激活、血管损伤等过程促进AMI 的发生和发展。 降香是一味活血化瘀中药，能够降低血瘀动物的血液黏度，改善梗死大鼠心肌组织损伤[15]。 因此，本文对降香治疗AMI 的潜在机制展开研究。

本研究首先对降香的入血成分进行分析，并对其进行网络药理学研究。结果显示黄酮类化合物是降香的主要入血成分，同时也是网络药理学研究预测的主要活性成分。 据报道，黄酮类化合物是降香中的主要活性成分之一，具有良好的心血管保护活性以及抗炎活性[16-17]。 另有研究发现，降香醇提物在体内外均具有促进血管新生的作用，分析发现醇提物含有多种黄酮类成分，推测可能是其药效成分[18]。上述成果提示，黄酮类成分可能是降香治疗AMI 的重要药效成分。

其次，研究通过PPI 网络的拓扑参数筛选出关键靶点，并对其进行富集分析，探讨可能调节的生物过程。 结果显示相互作用较强的SRC、EGFR 等靶点以及富集程度较高的PI3K/AKT、FOXO、HIF-1 等信号通路，可能是降香改善AMI 的活性靶点与潜在通路。 PI3K/AKT 信号通路是体内重要的调节体系，参与心功能障碍等多种生物学功能的调节[19-20]。而EGFR可与多种配体结合，作用于下游PI3K/AKT、MAPK等通路，参与细胞增殖、血管生成等作用[21]。 研究显示，降香醇提物可通过作用于血管内皮细胞生长因子受体和PI3K/MAPK 通路促进血管生成，芒柄花黄素可能是重要活性成分[18]。另外，柚皮素可通过介导PI3K/AKT 通路以及提高EGF 的表达等方式，促进大鼠梗死心肌的血管新生，改善大鼠心肌损伤[22-23]。FOXO 家族是一类重要的转录因子，其成员FOXO1诱导内皮细胞损伤，抑制血管新生；且FOXO1 过表达会引起缺血/再灌注小鼠心肌梗死面积增加[24-25]。而染料木素可调控FOXO1 转录活性，改善小鼠的血管新生[26-27]。 研究显示，HIF-1α 是机体介导低氧信号的重要转录因子，在AMI 患者血清中显著增加[28]。山柰酚是膳食黄酮的一种，能够有效抑制缺氧条件下的HIF-1 活性；也可以通过抑制NADPH 氧化酶活性，调控体内活性氧水平，减轻AMI 致使的心肌损伤[29-30]。 SRC 作为一种酪氨酸蛋白激酶，参与能量代谢、细胞增殖等多种生物学功能调节；有研究显示AMI 大鼠心肌组织SRC 被激活，抑制SRC 磷酸化则可减少心肌炎性浸润，减轻AMI 病变[31-32]。芒柄花黄素可显著抑制SRC 磷酸化，抑制炎症反应[33]。 在本研究中，上述成分与SRC、EGFR 等关键靶点具有较好的对接活性，进一步提示黄酮类成分可能是降香治疗AMI 的重要药效成分，并通过调控SRC、EGFR等靶点以及PI3K/AKT 等信号通路，参与调节机体炎症反应、氧化应激和血管新生等过程，治疗AMI。

综上所述，本实验通过UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技术，鉴定降香入血成分24 个，并借助网络药理学以及分子对接技术初步探索了降香治疗AMI 的潜在机制，为其进一步的体内、外研究提供理论依据。本研究是对作用机制的初步预测，今后需要进一步实验进行验证。