积雪草苷通过Nrf2/HO-1 信号通路对创伤脓毒血症大鼠肾损伤的保护作用研究

朱恒杰，曾允富*，程少文，郑林洋

海南医学院第一附属医院急诊和创伤外科，海南 海口 400000

脓毒血症是一种影响全身的炎症反应综合征，可由感染、创伤等原因导致，临床上属于危重症，死亡率极高[1]。 脓毒血症容易导致多组织、多器官的损伤，其中肾脏是最常见的受损器官，若不及时进行有效处理，疾病极易通过肾损伤发展为多器官衰竭，进而导致患者死亡[2]。 故本文以肾脏为脓毒血症疾病进展的代表进行研究。 在脓毒血症疾病进展的复杂病理机制中，氧化应激系统过度反应而平衡失调是脓毒血症致肾损伤的重要原因。 大量活性氧因子可通过氧化反应引发机体严重的应激损伤，造成肾小球肾小管等组织坏死，肾功能急剧下降。 因此，许多学者认为，调控并延缓生物体内的氧化应激反应，有望成为治疗脓毒血症肾损伤的关键环节[3-4]。

伞形科植物积雪草[Centella asiatica （L.） Urban]是一种源于中国广西的壮族医药，具有消肿、促进循环和利尿等功效[5]。三萜皂苷积雪草苷（asiaticoside,AS）是从积雪草中分离的一种天然化合物，在体外细胞培养和活体动物模型等实验中显示出广泛的生物活性，目前已经证实其具有抗氧化、抗炎、抗病毒、促进伤口愈合等多种药理作用[6-8]。 研究发现，AS可以通过降低小鼠肾组织中的诱生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）蛋白表达与血清中白细胞介素-6（interleukin-6, IL-6）的含量，减轻炎症反应，改善脓毒血症导致的急性肾损伤[9]。然而AS 是否能通过调控氧化应激反应从而对脓毒血症肾损伤发挥治疗作用，目前还未见报道。

血红素加氧酶1（hemeoxygenase-1, HO-1）是一种可以催化机体生产抗氧化剂的酶。 核因子E2 相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2）作为一种主要的转录因子，可以激活HO-1 等下游抗氧化应激因子的表达，调节细胞对氧化应激的反应[10-11]。朱时玉等[12]通过建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，证实AS 能够减少大鼠肾组织氧化应激水平，对肾损伤有保护作用，其机制与激活Nrf2/HO-1通路相关。 据此，本研究探讨AS 是否可通过Nrf2/HO-1 通路影响脓毒血症氧化应激反应，观察脓毒血症大鼠接受不同浓度AS 干预后，肾脏的功能与氧化应激水平的变化，以期进一步阐明AS 在脓毒血症治疗中发挥的药理作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

60 只雄性SPF 级SD 大鼠购自上海Sippr BK动物实验室，动物合格证号：SCXK（京）2021-0002，安置在屏障环境中（温度为20～25 ℃，湿度为50%～65%，光照12 h/d），以标准饲料喂养至10周龄，体质量(220±30) g。 本实验符合动物实验伦理要求，伦理审批号为：PZ-HNSZYY-2021-015。

1.2 主要试剂与仪器

AS （上海现代制药股份有限公司，批号：CY16830）；氨苄西林钠（国药集团威奇达药业有限公司，批号：ZY0769）；丙二醛（malonic dialdehyde, MDA）检测试剂盒（批号：S0131）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）检测试剂盒（批号：S0109）、RIPA裂解液（批号：R0010）、BCA 试剂盒（批号：R00011）、HE 染色试剂盒（批号：R01007）均购于上海碧云天生物技术有限公司；GAPDH（批号：5511）、Nrf2（批号：7023）、HO-1（批号：2897）均购自美国Cell Signal公司。

全自动生化分析仪（瑞士Roche 公司，型号：Cobas Integra 800）；自动酶标仪（美国Biotek Winooski 公司，型号：Bio-tekELX800）；蛋白电泳仪（型号：1659001）、半干转膜仪（型号：Trans-Blot SD）、Western blot 成像系统（型号：GS-900）均购于美国Bio-Rad 公司；低温高速离心机（德国Eppendorf 公司，型号：Centrifuge 5424R）；轮转切片机（型号：RM2035）、烤片机（型号：HI1220）均购于德国Leica 公司；生物显微镜（日本Nikon 公司，型号：EclipseE200）。

1.3 动物分组及建模

将所有大鼠标号，随机分为对照组（n=10）和脓毒血症组（n=50）。 脓毒血症组大鼠采用盲肠结扎法建立疾病模型：麻醉后以仰卧位固定大鼠于手术台上，消毒，沿中线剪开腹腔，取出盲肠，1 号线结扎，16 号线穿刺针刺穿盲肠，溢出少量粪便后，将盲肠还纳腹腔，缝合。 术后若大鼠苏醒时间较对照组明显延长，精神萎靡，活动与饮食减少，则认为建模成功[13]。对照组手术中无结扎和刺穿盲肠步骤。将脓毒血症组随机分为模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性组，每组10 只大鼠。 手术后12 h，若大鼠苏醒则开始灌胃给药。 以ZHU 等[14]在用AS 治疗糖尿病肾病大鼠模型中采用的剂量作为参考，将AS溶于生理盐水配制为1.0、2.5、5.0 mg/mL 的药液，分别给予低剂量组、中剂量组、高剂量组灌胃，对照组和模型组采用生理盐水灌胃，灌胃剂量均为10 mL/kg，阳性组腹腔注射氨苄西林钠200 mg/kg。

手术72 h 后，处置大鼠提取标本。 若有提前死亡大鼠，记录其生存时间并取样用于后续检测。

1.4 标本收集

硫喷妥钠40 mg/kg 静脉注射处死大鼠。从腹主动脉抽血于抗凝管中，3000 r/min，4 ℃离心15 min（离心半径40 cm）制备血清，分装标记后储存在-80 ℃冰箱备用。 取部分新鲜肾组织，用生理盐水清洗，部分用4%多聚甲醛固定，脱水、透明后石蜡包埋，制成3 μm 厚连续切片备用。 其余肾组织剪碎后置于蛋白裂解液中制备为匀浆液，3000 r/min，4 ℃离心20 min（离心半径40 cm），收集上清，BCA 法提取总蛋白质并测定蛋白质含量，分装标记后储存在-80 ℃冰箱备用。

1.5 肾脏病理形态观察

3 μm 厚连续切片经过脱蜡、脱二甲苯处理，苏木精染色2～3 min，盐酸乙醇分化15 s，伊红染色1 min，梯度脱水、透明后中性树胶封片。 在光学显微镜下观察肾脏的组织形态和病理变化。

1.6 Scr、BUN、MDA、SOD 水平测定

全自动生化分析仪检测血清中血肌酣（serum creatinine, Scr）和尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）含量水平。 根据ELISA 试剂盒说明检测MDA 和SOD值。

1.7 Nrf2、HO-1 蛋白表达水平测定

采用Western bolt 法检测Nrf2、HO-1 蛋白表达水平。 解冻前期收集蛋白样品，制备SDS-PAGE 凝胶。 将含有100 μg 蛋白质的样品加入凝胶孔，电泳、转移至PVDF 膜上，5%脱脂牛奶封闭4 h，TBST洗涤。 加入Nrf2、HO-1 一抗（均以1∶100 稀释），4 ℃下孵育过夜。 TBST 洗涤后，将膜放入山羊抗小鼠二抗（以1∶1000 稀释）中孵育1 h，TBST 清洗。 ECL显影，Western blot 成像系统扫描拍摄，ImageJ 软件对蛋白条带进行灰度分析。

1.8 统计学方法

采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析。 所有变量均为连续型变量，以“±s”表示。 根据样本量、数据是否正态分布、方差是否齐选取统计方法。 Kruskal-Wallis 检验用于分析整体差异，组间比较采用LSD-t检验。 P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 AS 对脓毒血症大鼠生存状况的影响

对照组无大鼠死亡，平均生存时间为72 h。 与对照组比较，模型组、低剂量组大鼠平均生存时间减少（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组及阳性组大鼠平均生存时间增加（P＜0.05）；与低剂量组比较，中剂量组、高剂量组及阳性组大鼠平均生存时间增加（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组及阳性组大鼠平均生存时间增加（P＜0.05）；高剂量组及阳性组大鼠平均生存时间差异无统计学意义（P＞0.05）。 详见图1。

图1 各组大鼠平均生存时间比较

2.2 AS 对脓毒血症大鼠肾脏病理形态的影响

光镜下可见对照组大鼠肾组织未见明显异常。模型组则出现明显的炎症反应，包括炎症细胞在肾组织中大量浸润，肾间质充血水肿，肾小管扩张，肾小球球囊黏连、系膜增生，表明模型建立成功。 而在AS 治疗各组中，肾组织炎症反应较模型组均明显减轻，并呈现剂量依赖性，高剂量组与阳性组组织形态趋于正常。 详见图2。

图2 各组大鼠肾脏组织病理变化（HE，×200）

2.3 AS 对脓毒血症大鼠肾功能指标的影响

与对照组比较，模型组Scr 和BUN 水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组及阳性组Scr 和BUN 水平均明显下降（P＜0.05）；与低剂量组比较，中剂量组、高剂量组及阳性组Scr和BUN 水平均明显下降（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组及阳性组Scr、阳性组BUN 水平降低（P＜0.05）；与高剂量组比较，阳性组BUN 水平升高（P＜0.05）。 详见图3。

图3 各组大鼠Scr、BUN 水平比较

2.4 AS 对脓毒血症大鼠氧化应激指标的影响

与对照组比较，模型组大鼠MDA 水平升高、SOD 水平降低（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组及阳性组MDA 水平降低、SOD水平升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，中剂量组、高剂量组及阳性组MDA 水平降低、SOD 水平升高（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组及阳性组MDA 水平降低、SOD 水平升高（P＜0.05）；与高剂量组比较，阳性组MDA 水平升高（P＜0.05）。 详见图4。

图4 各组大鼠MDA、SOD 水平比较

2.5 AS 对脓毒血症大鼠Nrf2、HO-1 蛋白表达水平的影响

与对照组比较，模型组Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平降低（P＜0.05）。与模型组比较，低剂量组、中剂量组、高剂量组及阳性组Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，中剂量组、高剂量组及阳性组Nrf2 和HO-1 蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与中剂量组比较，高剂量组及阳性组Nrf2 和HO-1蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与高剂量组比较，阳性组HO-1 蛋白表达水平降低（P＜0.05）。 详见图5。

图5 各组大鼠Nrf2 和HO-1 蛋白相对灰度值的比较

3 讨论

AS 作为传统中药的提纯物，在动物实验中表现出对脓毒血症的缓解作用[9]，然而其具体药理机制尚未明确。 本文通过盲肠结扎法建立脓毒症大鼠模型，结果显示，与对照组比较，模型组生存时间更短，肾组织炎症反应明显，肾功能下降，氧化应激水平升高，表明模型建立成功。 AS 在中医中被用于治疗肾脏疾病，多项研究证实了AS 具有肾脏保护作用[9，12，15]。本文结果显示，经AS 治疗后，脓毒血症大鼠的生存时间延长，HE 染色可见肾组织炎症反应减轻，Scr和BUN 水平均下降。上述结果表明肾功能以及疾病整体状况得到了改善，AS 可以保护脓毒血症大鼠肾功能，然而目前对于AS 治疗肾脏疾病的机制仍不明确。

本研究选取了MDA 和SOD 作为氧化应激水平的衡量标志。MDA 属于脂质过氧化反应的终末产物之一，是体内重要的氧化应激监控指标，其含量与机体内氧化应激严重程度呈正相关[16]。 SOD 是一种具有抗氧化功能的金属酶，可催化超氧化物阴离子的歧化反应，抑制氧化应激损伤[17]。 本研究中，AS 治疗各组与模型组相比，MDA 水平明显下降，而SOD 水平上升，说明AS 具有抑制大鼠氧化应激反应的作用。

进一步研究机制发现，模型组大鼠Nrf2 与HO-1蛋白表达水平均较对照组更低，而AS 治疗可逆转此降低趋势，升高Nrf2 与HO-1 蛋白表达水平。 这可能是AS 抑制氧化应激反应的机制。Nrf2/HO-1 通路是体内重要的抗氧化应激通路，Nrf2 激活后，诱导HO-1 产生，催化血红素降解成一氧化碳和亚铁，后者具有抗氧化、抗炎作用，可抑制和拮抗氧化应激反应。 另外，Nrf2 还可以增加SOD 等抗氧化剂的表达，减轻机体氧化反应[10-11]。 在多种肾脏损伤模型中，通过激活Nrf2/HO-1 通路抑制氧化应激反应均取得了一定的治疗效果[18-20]。 在小鼠的肾缺血再灌注损伤模型中，茯苓酸可降低MDA 和环氧合酶2的水平，增加谷胱甘肽等一系列抗氧化因子的表达，发挥肾损伤保护作用，其原理被认为和直接或间接激活Nrf2，上调下游GPX4、SLC7A11 和HO-1 的表达有关[18]。刘华[19]、王文文[20]等也利用不同的药物干预缺血再灌注肾损伤模型，证明药物可通过Nrf2/HO-1通路缓解氧化应激反应，改善缺血再灌注造成的肾损伤。 此外，在叶酸诱导的肾损伤模型[21]、草酸钙肾结石模型中[22]，Nrf2/HO-1 的激活可以有效降低机体内的氧化应激指标含量。与本研究脓毒血症模型中，AS 通过Nrf2/HO-1 抑制氧化应激反应相互印证。

本研究结果显示，不同浓度AS 的疗效呈现剂量依赖性，其中，高剂量组与模型组对比疗效最为明显。 此外，高剂量组大鼠BUN 和MDA 水平较阳性组更低，HO-1 蛋白表达水平较阳性组更高，其余指标与阳性组相比差异无统计学意义。 表明AS 对肾脏的保护作用与氧化应激反应的抑制作用随剂量升高而增强，且较抗生素治疗有一定的优势。

综上所述，AS 可能通过Nrf2/HO-1 通路，抑制氧化应激反应，改善脓毒血症大鼠的症状，延缓疾病进展，其作用呈现剂量依赖性，可能的机制与AS 上调Nrf2/HO-1 通路有关。