高迁移率族蛋白1对系统性红斑狼疮肾损伤肾小球内皮细胞通透性影响

田 玉，杨玉淑，韩玉祥，丁 萌，彭晨星

河北医科大学第二医院 风湿免疫科，河北 石家庄 050000

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一种累及多器官、多系统，具有高异质性特征的自身免疫性疾病[1-2]。炎症反应和免疫紊乱是SLE发生发展的病理基础[3]。肾小球滤过屏障(glomerular filtration barrier，GFB)受损所导致的蛋白尿是SLE肾损伤的重要临床表现，而人肾小球内皮细胞(human glomerular endothelial cell，HRGEC)是GFB的重要组成部分。因此，探讨HRGEC在SLE肾损伤中的作用十分重要。高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)是一种存在于真核细胞核中的非组蛋白核蛋白，细胞损伤后，HMGB1可大量释放至细胞外，除直接刺激细胞，还会与DNA、细胞因子、外源性因子、核小体等形成免疫刺激复合物，在自身免疫性疾病和炎症的发生发展中具有重要作用[4]。有研究表明，狼疮性肾炎(lupus nephritis，LN)患者血清HMGB1水平明显升高，且与蛋白尿、狼疮活动指数呈正相关[5]，提示HMGB1可能参与了SLE患者肾损伤的发生过程。但HMGB1是否参与了SLE中HRGEC的损伤尚未明确。本研究以SLE肾损伤患者血浆刺激HRGEC来模拟疾病的微环境，旨在探讨HMGB1在SLE中对HRGEC通透性的影响，以期为临床治疗提供理论依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2020年1月至2022年3月于河北医科大学第二医院行血浆置换术治疗的50例SLE患者为研究对象。以24 h尿蛋白定量0.5 g为标准将患者分为A组(无蛋白尿，n=27)和B组(有蛋白尿，n=23)。另选取同期于我院体检的50例健康者纳入健康组。SLE患者纳入标准：(1)符合SLE诊断标准[6]；(2)未合并血液系统疾病或恶性肿瘤；(3)未合并重要器官严重损伤；(4)临床资料完整。排除标准：(1)合并糖尿病；(2)妊娠或哺乳期女性；(3)精神状态较差，无法配合本研究。A组中，男性3例，女性24例；年龄29～53岁，平均40.90岁。B组中，男性5例，女性18例；年龄20～56岁，平均37.80岁。健康组中，男性11例，女性39例；年龄25～62岁，平均40.92岁。各组研究对象年龄、性别比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 血清学检查 采集所有研究对象空腹静脉血，离心收集血浆，采用酶联免疫吸附法检测血浆HMGB1、内皮素-1、溶性血管细胞黏附分子(soluble vascular cell adhesion molecule，sVCAM-1)水平，所有操作均按照试剂盒说明书进行。HMGB1、sVCAM-1、内皮素-1酶联免疫吸附试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2.2 HRGEC培养 原代HRGEC购自美国sciencell公司。使用含10% FBS、Penicillin、Streptomycin、生长添加剂的ECM培养基培养HRGEC，每2～3 d换液1次，将细胞置于含5%二氧化碳的细胞培养箱中，37℃静置培养。

1.2.3 CCK8检测细胞活力 将HRGEC分为control组与LN组。control组以健康者血浆刺激细胞，LN组以SLE肾损伤血浆刺激细胞，刺激浓度分别为0、5%、10%、15%和20%，孵育24 h后利用CCK8试剂盒检测各组细胞的增殖活力。

1.2.4 跨膜电阻检测 利用transwell小室构建HRGEC单层，应用跨细胞电阻仪测定control组与LN组SLE肾损伤血浆刺激6 h、12 h、18 h、24 h细胞层的跨膜电阻(transepithelial electrical resistance，TEER)。Transwell小室使用前给予牛纤维连接蛋白包被，加入全培养基在培养箱平衡过夜。将HRGEC细胞悬液以1×105个/ml接种于transwell小室上室，下室加入培养基，另设只有培养基的空白孔。镜下观察细胞呈融合状态，且反复多次跨膜电阻仪测定TEER值稳定24 h以上，提示HRGEC单层构建成功。测量空白孔的电阻值，连续测量3次，取平均值。TEER值=(各孔电阻值-空白孔电阻值)×transwell上室底面积，结果重复5次。

1.2.5 FITC-BSA法检测HRGEC单层的通透率 测定control组与LN组SLE肾损伤血浆刺激6 h、12 h、18 h、24 h的HRGEC单层的通透率。在transwell小室上室接种细胞，待TEER值稳定24 h后，PBS漂洗小室，根据分组在上室分别加入相应的试剂，同时加入5 mg/ml的FITC-BSA 0.1 ml，下室加入等摩尔、无标记的BSA 0.3 ml，避光环境下37℃细胞培养箱孵育。按照实验设计要求孵育不同时间后，分别从上室及下室吸取培养基，倍比稀释，利用荧光分光光度计检测上室、下室样品的荧光强度(激发波长495 nm，发射波长520 nm)。FITC-BSA购自北京索莱宝科技有限公司。

采用通透系数(P)表示内皮细胞单层对BSA的通透性大小，通透率的计算公式：P=[F](1/A)(v/[L])。[F]为下室FITC-BSA的荧光强度，A为transwell上室底面积，v为下室溶液体积，[L]为上室荧光强度。每组实验重复5次，取平均值。

通透率=(LN组P/control组P)×100%

1.2.6 细胞免疫荧光法检测血管内皮细胞钙黏蛋白的表达 以冰生理盐水冲洗LN组与control组细胞，4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗后给予0.5% Triton 100打孔，再次PBS冲洗，正常山羊血清封闭后滴加兔抗血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-cadherin)一抗(1∶200)， 4℃过夜，滴加FITC-羊抗兔IgG，37℃孵育后PBS冲洗，防淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜观察，拍照。兔抗VE-cadherin单克隆抗体购自CST公司。

1.2.7 HMGB1对HRGEC单层的通透率的影响 细胞分组：control组、LN组、LN+HMGB1中和抗体(LN+H ab)组、LN+对照IgG抗体(LN+IgG ab)组。control组给予健康血浆刺激细胞，LN组给予SLE肾损伤血浆刺激细胞，LN+H ab组及LN+IgG ab组分别给予HMGB1中和抗体(沈阳万类生物)及对照IgG抗体预处理细胞30 min，然后给予SLE肾损伤血浆刺激细胞12 h，其他操作同1.2.5。

2 结果

2.1 各组研究对象血浆HMGB1、内皮素-1、sVCAM-1水平比较 A组和B组血浆HMGB1、内皮素-1、sVCAM-1水平均明显高于健康组，且B组高于A组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组研究对象血浆HMGB1、内皮素-1、sVCAM-1水平比较

2.2 CCK8细胞活力检测结果 CCK8结果显示，随着血浆刺激浓度的增加，control组细胞活力无明显改变(P>0.05)；当刺激浓度为10%、15%、20%时，LN组细胞活力明显下降(P<0.05)，因此在后续的试验中选取10%作为刺激浓度。见图1。

图1 CCK8细胞活力检测结果

2.3 SLE肾损伤血浆刺激HRGEC不同时间TEER值变化 LN组刺激12 h、18 h、24 h的TEER分别为(7.33±1.03)Ω·cm2、(6.15±1.18)Ω·cm2、(4.77±1.32)Ω·cm2，均显著低于control组的(11.23±0.58)Ω·cm2，差异有统计学意义(P<0.05)。LN组刺激6 h的TEER为(11.03±1.40)Ω·cm2，与control组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 SLE肾损伤血浆刺激HRGEC不同时间通透率变化 LN组刺激6 h时HRGEC的荧光通透率为(104.27%±6.59%)，与control组的100.00%比较，差异无统计学意义(P>0.05)。LN组刺激12 h、18 h、24 h的通透率分别为(137.22%±14.88%)、(156.92%±14.28%)、(200.06%±10.08%)，均显著高于control组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.5 SLE肾损伤血浆刺激HRGEC细胞间VE-cadherin表达结果 免疫荧光结果显示，control组VE-cadherin于细胞间紧密连接处连续表达，而LN组VE-cadherin的分布不连续，细胞间隙增大，部分VE-cadherin表达在细胞浆，提示细胞间紧密连接受损。见图2。

2.6 HMGB1中和抗体预处理后各组HRGEC细胞TEER值及荧光通透率变化 与control组比较，LN组的TEER值明显下降、荧光通透率明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与LN组比较，LN+H ab组TEER值明显升高、荧光通透率明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3～4。

图2 免疫荧光检测HRGEC细胞膜上的VE-cadherin表达(a.control组；b.LN组；bar=25 μm) 图3 各组HRGEC细胞TEER值检测结果 图4 各组HRGEC细胞荧光通透率检测结果

2.7 HMGB1中和抗体预处理后各组HRGEC细胞间VE-cadherin表达 免疫荧光结果显示，LN+H ab组细胞间VE-cadherin的表达较LN组有所增加，提示细胞间紧密连接有所改善。见图5。

图5 免疫荧光显示各组HRGEC细胞间VE-cadherin表达的情况(a.control组；b.LN组；c.LN+H ab组；d.LN+IgG ab组；bar=25 μm)

3 讨论

HRGEC是一种高度分化的内皮细胞，位于GFB的最外层。GFB的屏障功能和完整性对于维持血管稳态至关重要，当内皮细胞受损，细胞间的紧密连接松散，细胞形态收缩，一些大分子物质如白蛋白从细胞旁漏出，导致肾小球毛细血管通透性增加，进而出现蛋白尿。有研究报道，SLE患者存在内皮细胞损伤，且SLE与动脉粥样硬化进展及心血管事件风险有关[7]。内皮素-1是一种由血管内皮细胞产生的高效内源性血管收缩肽，参与了慢性肾病的发生发展，且与SLE活动度有关[8-9]。sVCAM-1已被证实在LN患者的血清中明显升高，且与内皮细胞损伤有关[10]。本研究结果显示，A组和B组患者血浆内皮素-1、sVCAM-1水平均明显升高，且B组升高更为明显，提示SLE肾损伤患者存在更严重的内皮血管病变。此外，在体外试验中，笔者利用transwell小室构建HRGEC单层模型以模拟肾小球内皮屏障，以SLE肾损伤血浆刺激HRGEC，结果显示，HRGEC单层的跨细胞电阻降低、荧光通透率增加，细胞间VE-cadherin表达减少，细胞间紧密连接破坏，提示SLE肾损伤患者HRGEC单层的通透性增加。

HMGB1是高迁移率族蛋白家族成员，具有25 kda的分子量和2个带正电荷的核酸结合序列。细胞外的HMGB1作为一种损伤相关分子模式，会激活免疫系统并促进炎症发生[11]。有研究报道，活动性LN的SLE患者血液及尿液中HMGB1水平较健康者明显升高[12-13]。本研究结果显示，血浆HMGB1在SLE患者中明显升高。这提示，HMGB1可能在SLE肾损伤中发挥重要作用。HMGB1可以与TOLL样受体2和4结合，诱导肾小球系膜细胞的增殖[14-15]，沉默HMGB1基因可以减少过敏性紫癜患儿血管内皮细胞凋亡，改善血管的通透性[16-18]。HMGB1可能参与了SLE肾血管内皮的病理过程[19-20]。为进一步探讨HMGB1在SLE肾损伤中对HRGEC单层通透性的影响，本研究应用HMGB1中和抗体预处理细胞，然后再给予SLE肾损伤血浆刺激，结果显示，HMGB1中和抗体部分逆转了HRGEC单层的跨膜电阻及荧光通透率，改善了细胞间VE-cadherin的表达。

综上所述，SLE患者血清中HMGB1水平明显升高，且存在肾损伤者更为明显，HMGB1中和抗体能够部分逆转HRGEC单层的通透性，改善细胞间的紧密连接，HMGB1可能参与了SLE的HRGEC损伤。