10种中草药提取物对棉铃虫、绿盲蝽触杀活性研究

丛胜波, 万 鹏, 李文静, 李 栋, 孙 俊, 尹海辰*

(1.湖北省农业科学院植保土肥研究所, 农业农村部华中作物有害生物综合治理重点实验室,农作物重大病虫草害防控湖北省重点实验室, 武汉 430064; 2.中化现代农业(湖南)有限公司, 长沙 410205)

棉铃虫Helicoverpaarmigera,属于鳞翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae,绿盲蝽Apolyguslucorum,属于半翅目Hemiptera盲蝽科Miridae,两种害虫广泛分布于世界各地,在我国棉花、蔬菜和果树种植区均有发生,寄主种类均在200种以上,棉铃虫可为害番茄、白菜、甘蓝等,绿盲蝽则对苹果、枣、葡萄等50余种经济作物生产造成严重影响[1-3]。棉铃虫曾经在我国长江及黄河流域棉花种植区造成严重危害,随着Bt棉花的种植,该虫的危害得到了有效的控制,绿盲蝽上升成为我国棉花的主要害虫。然而在Bt棉花的高强度种植区,已有棉铃虫耐受性提升的报道[4-5],绿盲蝽由于具有世代重叠严重、飞行能力强等特点,抗药性风险日益严重[6-7]。综上所述,急需寻找一种对棉铃虫、绿盲蝽安全高效的防治新手段。

我国的中草药植物是一类重要的植物资源,除去在医药上的应用外,利用植物防治害虫具有悠久的历史,早在2000多年前我国就已有相关记载,近年来科研人员筛选了多种具有较高杀虫活性的中草药植物提取物[8-10]。相比于传统化学农药,这些植物源农药来源于自然,对害虫的作用方式多样,因此具有污染小，易降解,害虫不易产生抗性等优点[11-12]。本研究选取了10种中草药植物,制备了其乙醇提取物,测定了乙醇提取物对棉铃虫、绿盲蝽两种害虫的触杀活性,并采取萃取、硅胶柱分离等手段,初步对其有效成分进行了分离,本研究以期为两种害虫高效安全的新型药剂开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试虫饲养

试验所用绿盲蝽和棉铃虫采集自湖北省武汉市、鄂州市等地棉田,在实验室内于(26±1)℃,光周期L∥D=16 h∥8 h,相对湿度60%条件下分别用四季豆和人工饲料饲养多代,饲养期间未接触任何药剂。

1.2 供试中草药粗提取物的制备

选用苦杏仁(种子)、云木香(根)、香加皮(根皮)、大黄(根)、萹蓄(全株)、薄荷(地上部分)、紫花地丁(全株)、韭菜籽(种子)、泽漆(全株)、五加皮(树皮)等10种中药材,本研究所用中草药均采购自湖北中医药大学,将100 g供试中药打成粉末后置于250 mL无水乙醇中室温浸泡15 d,将提取液用旋转蒸发仪蒸干溶剂获得膏状提取物。

1.3 植物提取物对棉铃虫、绿盲蝽的触杀活性测定

将100 mg中草药乙醇粗提物用少量乙醇溶解,用蒸馏水将样品稀释至15 mg/mL,每种粗提物配制1 mL药液用于试验。每种粗提物设置3组重复,每个重复20头2龄棉铃虫幼虫或2龄绿盲蝽若虫,以含有少量乙醇的蒸馏水为对照组。将试虫置于培养皿中,用POTTER喷雾塔(北京安迪永富科贸有限公司,ADPT-1型)喷雾处理,处理后棉铃虫置于24孔板内饲养,每孔放入1块人工饲料(1 cm3大小)并接入1头棉铃虫幼虫;绿盲蝽置于玻璃指形管(直径2 cm,高5 cm)内饲养,每个指形管放入1块四季豆(长约4 cm)并接入20头绿盲蝽若虫。统计药后1、3、7 d棉铃虫幼虫和绿盲蝽若虫死亡率。

1.4 不同极性溶剂萃取及萃取物生测

选择触杀活性较高的粗提物进行不同溶剂萃取,将10 g粗提物用500 mL纯净水溶解后,依次使用等量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇4种极性不同溶剂进行萃取,萃取后使用旋转蒸发仪蒸干溶剂,获得萃取物,将萃取物用于棉铃虫、绿盲蝽触杀活性的生测,生测方法、浓度及用量等同上。

1.5 萃取物硅胶柱层析分离及生测

硅胶柱层析分离方法参考李秀梅等[13]的报道,选择触杀活性较高的萃取物,利用相应溶剂溶解。采用湿法装柱,选用200～300目硅胶为吸附剂,洗脱液为石油醚∶乙酸乙酯(3∶1)。每份300 mL,收集流分并编号,并通过经TLC检测合并相邻流分中含有相同Rf值洗脱物的流分。流分经旋转蒸发后,供杀虫活性测定使用,生测方法、浓度及用量等同上。

1.6 数据处理

根据公式计算校正死亡率：

校正死亡率=(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100%。

不同植物提取物、萃取物及流分之间的校正死亡率通过单因素方差分析LSD法分析,分析软件使用SPSS Statistics 17.0。

2 结果与分析

2.1 植物提取物对棉铃虫、绿盲蝽的触杀活性

中草药乙醇粗提物生测结果表明, 10种乙醇粗提物对棉铃虫2龄幼虫均具有一定的触杀效果,其中经香加皮和苦杏仁处理后的棉铃虫幼虫,药后7 d校正死亡率较高,分别为56.8%和65.4%(表1)。而对于绿盲蝽2龄若虫,粗提物触杀效果较为显著,除五加皮提取物外,其余9种提取物均具有显著的触杀活性,药后7 d校正死亡率均在80%以上(表2)。

表1 中草药乙醇粗提物对棉铃虫2龄幼虫的触杀活性1)

表2 中草药乙醇粗提物对绿盲蝽2龄若虫的触杀活性

2.2 不同极性溶剂萃取组分对绿盲蝽的活性

由表1和表2可知,中草药粗提物对于棉铃虫的触杀活性相对较差,因此后续选择绿盲蝽若虫为试验对象。苦杏仁和萹蓄提取物对于绿盲蝽触杀作用均较强,但萹蓄的提取率较低,因此选择苦杏仁进行后续试验。在进行分离萃取时,由于乙酸乙酯、正丁醇萃取蒸干后获得的提取物质量过低,因此无法进行生测;当加入氯仿后苦杏仁粗提物出现析出物,这种析出的不溶物对绿盲蝽触杀活性最高,药后7 d校正死亡率达96.9%;而氯仿和石油醚的萃取物药后7 d对绿盲蝽的校正死亡率仅为6.2%和7.3%,水相未表现出杀虫活性(表3)。由于氯仿萃取时析出物对绿盲蝽表现出最高的触杀活性,因此选择其进行层析柱分离。

表3 苦杏仁4种萃取物对绿盲蝽2龄若虫的触杀活性

2.3 苦杏仁萃取物硅胶柱层析分离及生物活性

苦杏仁粗提物经氯仿萃取时析出的不溶物经层析柱分离后可产生4组流分,生测结果表明,流分L36-48对绿盲蝽2龄若虫的触杀活性最高,校正死亡率可达84.7%(表4)。而L8-15、L18-24两组流分校正死亡率低于50%。

表4 苦杏仁氯仿萃取析出物不同流分对绿盲蝽2龄若虫的触杀活性

3 讨论

本文利用10种中草药提取物对棉铃虫、绿盲蝽开展触杀活性测定,结果表明，中草药提取物对绿盲蝽具有较好的触杀活性,其中苦杏仁提取物校正死亡率最高。进一步分离发现活性成分可能存在于氯仿萃取时的析出物中,且流分L36-48触杀活性最高。

目前,中草药提取物的杀虫活性已受到科研人员的广泛关注。王谦等[14]采用药膜法测定了5种中草药提取物对菇蝇的毒杀活性,结果表明，百部Stemonajaponica和苦参Sophoraflavescens对菇蝇的毒杀活性显著;方涛等[15]测定了28种植物提取物对棉蚜Aphisgossypii的杀虫活性,结果发现曼陀罗Daturametel、毒参Coniummaculatum、大戟Euphorbiapekinensis等8种植物提取物具有较高杀虫活性,其中曼陀罗提取物杀虫活性最高;Abdelatti和Hartbauer[16]研究发现,葛缕子Carumcarvi、橘皮Citrusaurantiumdulcis和平铺白珠树Gaultheriaprocumbens等3种提取物的复配剂对蝗虫具有较好的防治效果,喷施24 h后试虫死亡率可达80%～100%,且该提取物对于小麦幼苗无药害。本文通过对萝藦科、蔷薇科、大戟科等10种中药材提取物杀虫活性的研究,为中草药植物资源的利用提供了理论支持。

目前,苦杏仁提取物已被证实对家蝇Muscadomestica、玉米象Sitophiluszeamais、白纹伊蚊Aedesalbopictus以及黏虫Mythimnaseparata具有很好的熏蒸、触杀活性[17-19]。但对于其有效成分分离鉴定的相关研究较少,马玉花等[19]的研究发现,去除HCN的苦杏仁精油的杀虫活性显著高于含HCN的苦杏仁精油,其原因可能是精油中微量的HCN不足以对试虫造成毒杀作用,而除去HCN后反而提升了精油中有效成分的含量。于新池[20]的研究表明,苦杏仁精油主要成分是苯甲醛、苯甲酸、二甲苯、正十六烷等,然而其抗菌杀虫活性并不能完全归因于其主要成分苯甲醛。由此可见,苦杏仁的活性成分目前尚不明确,本文对其有效成分开展了初步的分离鉴定,为后续研究奠定了基础。

在当前棉花害虫抗药性风险日益严峻的情况下,利用中草药植物资源开发新型药剂是解决防治问题的重要思路。在今后研究中还应继续开展中草药植物活性物质的鉴定,同时在触杀作用以外,苦杏仁等植物提取物还可能存在熏蒸、驱避等多种作用方式,综合利用这些植物资源是开发害虫高效安全的防治手段的基础。