数字PCR技术在国门生物安全保障领域的应用

王艺凯 齐 玮 杨 诣 王占坤 王胜利 陈芊如 孔维恒 芮 孝 邱 烨 刘 鑫*

（1.中国海关科学技术研究中心，北京 100026；2.南佛罗里达大学，佛罗里达州 33620；3.新羿生物科技（北京）有限公司，北京 102299；4.清华大学医学院生物医学工程系，北京 100084）

1 前言

国门生物安全是人民健康、社会安定、国家利益的重要保障。当前，国门生物安全已成为我国面临的重大安全问题和重要挑战。随着我国出入境人员和进出口货物的逐年增加，海关检验检疫的工作量也急剧增加。此外，对进出口食品检验、饲料中的动物源成分检测，转基因植物检测需求也逐年增加，同时还要求检测时间更短、检测结果更加精准。核酸检测以其灵敏度高、特异性好、操作简便、时间短的特点已经被广泛用于各种病原体的检测和动植物来源物质的鉴别等领域，而数字PCR作为第三代PCR技术，以其灵敏度高、绝对定量、耐抑制好等特点受到生物检测领域业内人士越来越多的关注。

“ 数字PCR ”的概念最早于1999年由霍普金斯大学的Kenneth Kinzler 与 Bert Vogelstein 明确定义，他们在论文中描述了通过分割样品于96孔板和384孔板中进行一系列的PCR来定量检测样品中的Kras突变的方法[1]。数字PCR技术的核心概念是将荧光定量PCR反应体系分割为大量独立的PCR子反应，每个子反应单元中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子，每个子反应单元进行平行的PCR扩增，扩增结束后，对每个子反应单元的终点荧光信号进行分析。由于目标核酸分子的分散符合泊松分布，通过统计阴性和阳性子反应单元的数目和统计学方法分析就能计算出原始样品中目标核酸分子的拷贝数[2]。数字PCR中最常见的微小反应单元形式包括液滴和微孔，其中液滴数字PCR采用基于微流控的液滴技术实现PCR反应体系的分割[3]；微孔数字PCR采用基于微纳米加工技术的微孔芯片形成大量独立的反应单元[4]。

数字PCR相较于传统PCR技术和荧光定量PCR技术，具有绝对定量、灵敏度高、精度高、对抑制剂容忍度高的优势。根据上述的数字PCR原理可知，此技术可以直接计算目标核酸分子的拷贝数，无需如荧光定量PCR一般依赖于对照样品和标准曲线进行定量，因此数字PCR能够提供更准确可靠的定量结果，理论上可以达到定量单个分子的效果。此外，由于样品被分散在大量隔离的微反应单元中，目标模板受到背景模板的竞争和干扰减少，因此数字PCR的灵敏度更高，能够在野生型模板的背景下检测罕见的突变[5]。同时，大量分散也使得数字PCR对样品中存在的抑制剂有更高的容忍度。

由此可见，数字PCR这一新兴的核酸检测技术能够“ 满足 ”海关检验检疫精准定量的需求。本文将对数字PCR技术在国境卫生检疫、动物病原菌检疫、植物病原菌检疫、动物源性成分检测及转基因产品检测等方向的研究进展和应用前景进行介绍和论述。

2 数字PCR技术在国境卫生检疫中的应用

2.1 高灵敏度新冠病毒核酸检测

目前被广泛用于COVID-19诊断的RT-qPCR检测技术为疫情防控提供了很大的帮助，但其存在假阴性率高的问题[6,7]。引物和探针靶区域突变、样本中的病毒量不足、采样过程不规范、运输不当和样本中存在扩增抑制剂等多种因素都可能造成假阴性结果[8]。而数字PCR技术因其灵敏度高和耐抑制较好的特性，能够有效的减少检测SARS-CoV-2时出现的假阴性结果。在比较基于数字PCR和RT-qPCR的 SARSCoV-2检测方法的最低检测限（LoD）的研究工作中，科研人员发现数字PCR的方法具有更低的LoD和更高的灵敏度[9-11]。对比临床样本的阳性检出率，部分RT-qPCR检测为疑似或阴性的COVID-19 样本，数字PCR都成功检测出阳性[9,11-15]。其中，在Suo等人[9]的研究中，26例COVID-19确诊患者的样本被数字PCR成功检 出，而这些样本的RT-qPCR检测结果均为阴性。此外， Falzone等人[10]的研究也显示数字PCR对扩增抑制剂的作用较不敏感。由此说明，数字PCR在低病毒载量样本的检测 中具有优势，能够作为RTqPCR的补充。

2.2 流感病毒的定量和分型

流感病毒目前仍然是对公共卫生具有巨大威胁的呼吸道病原体[16]。通过每年注射疫苗的方法，我们可以最大程度的降低季节性流感造成的危害，而疫苗是否有效取决于对每年流感病毒的准确定型。现在世界范围内造成季节性流感的流感病毒主要有两个型别，4种亚型，分别是甲流H1、甲流H3、乙流Victoria和乙流Yamagata[17]，在流感病毒感染者中有0.5%～3%的是双重感染。荧光定量PCR法可以对甲乙流病毒进行分型，也可以对乙流病毒的两种亚型进行区分，但还没有用荧光定量PCR法对流感病毒的4种亚型进行同时分型检测的报道。香港大学Leong等人开发的数字PCR流感病毒六重联检方法，可以在一管内同时检测区分流感病毒的4种亚型[18]。与多管分别检测相比，单管多重联检在降低试剂成本、减少样品消耗、缩短操作时间和降低移液误差等方面有明显优势。Leong等人开发的方法中另外两重检测是对甲乙流病毒分别进行精确定量。对流感病毒的精确定量可以方便医生评估病情和对临床准确预测临床结果。而荧光定量PCR法由于对病毒定量要依赖外部标准品，对信噪比有较高的要求，造成不同实验室的检测结果存在较大差异，可重复性较差。

2.3 HIV感染者治疗效果的评估

现在全球大约有七千万HIV感染者，我国的HIV感染者也有逐年增加的趋势。随着抗病毒药物的发展，目前的抗逆转录病毒疗法（ART）通过抑制病毒复制可以有效地抑制HIV感染者血浆中的病毒量。很多感染者的血浆病毒血症被抑制在目前可用的诊断方法的检测限以下[19]。然而，即使在最佳治疗的情况下，很大一部分患者仍处于低水平病毒血症状态[20,21]，在体内形成所谓的HIV库。量化具有复制能力的HIV库对评估治疗策略至关重要。加州大学圣地亚哥分校的Strain等人以HIV的pol基因和2-LTR为靶点开发了一种数字PCR检测方法[22]。经过对300多份临床样本的检测分析，与qPCR相比，这个方法的检测精度有显著的提高，特别是病毒载量较低的样本。实验结果显示pol拷贝数的变异系数平均下降了5倍，2-LTR的检测精度提高了20倍。哈佛医学院Henrich等人的研究得出了类似的结果[23]。比利时根特大学和根特大学医院的Kiselinova等人以细胞相关HIV RNA为靶点，对比了数字PCR和巢式qPCR法，数字PCR在检测病毒载量较低的样本时有明显的优势[24]。在2013年对一个因母婴传播而感染HIV的婴儿进行抗病毒治疗时，采用了数字PCR检测病毒载量[25]。婴儿出生18个月后HIV检测不到后停止了治疗，婴儿30个月大时复诊仍保持HIV检测不到，实现了对HIV感染的治愈。整个治疗过程中数字PCR对HIV病毒的高灵敏检测起了至关重要的的作用。

2.4 登革热病毒检测

登革热病毒是一种通过蚊虫传播的病毒，每年造成约3.9亿人感染。它会引起登革热、出血性登革热和登革休克综合征，是所有热带国家和地区的一个主要的公共卫生问题[26,27]。目前，还没有针对登革热病毒的特效药和疫苗[28]，对登革热、出血性登革热和登革热休克综合征只能进行对症治疗。快速准确的确诊登革热病毒感染可以帮助医护工作者提供有效合理的治疗措施。现有的基于免疫学的检测方法可以快速得到检测结果，但灵敏度有限[29,30]，qRT-PCR法虽然有较高的灵敏度，但因为需要标准曲线进行校正，而配制标准品和绘制标准曲线受人为等外界影响较大，增加了检测结果错误的几率，也造成不同实验室间的检测结果差别较大，无法互相参考。泰国国家科学技术发展局的Mairiang等人以登革热病毒的保守序列为检测靶点，开发了数字PCR登革热病毒检测方法，可以对4种亚型的登革热病毒实现准确检测[31]。相较于qPCR法，数字PCR法具有更低的检测下限和定量下限，不同实验室间的检测结果的一致性也更好，为药物和疫苗的多中心临床实验提供了保障。此外，利用了数字PCR绝对定量的特点，Mairiang等人还发现登革热病人和出血性登革热病人样本中病毒载量有明显差别，证实了病毒载量与病情轻重之间的关系。由于登革热病毒有4种亚型，所以在疫苗研发的过程中要对一个样本中的4种登革热病毒同时定量。法国巴斯德公司的研发人员利用数字PCR适合做多重检测的特点，开发了在一管中同时定量4种亚型的登革热病毒的方法[32]。整个方法的检测结果与qPCR法单独亚型检测具有很好的一致性，但大大降低了对工作量和样品量的要求。

3 数字PCR技术在动物检疫中的应用

3.1 非洲猪瘟病毒检测

非洲猪瘟病毒（ASFV）会引起严重的跨界传染病——非洲猪瘟，给养猪业造成了巨大的经济损失。为预防和控制非洲猪瘟，一旦出现可疑症状，应立即停止动物和猪肉制品的流动，然后通过实验室检测进行诊断。郑州大学的Jia Rui等人和四川农业大学的Wu Xulong等人分别在不同的数字PCR平台上开发了非洲猪瘟病毒检测方法[33,34]。相较于qPCR，数字PCR法展现了更好的可重复性和耐抑制性，其中四川农业大学开发的数字PCR方法的检测下限达到了10拷贝/测试，检测灵敏度是qPCR的10倍。 广西大学的Shi Kaichuang 等人开发了一种数字PCR多重联检方法，可以在一管内同时检测非洲猪瘟病毒、普通猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒。与多重qPCR相比，该方法具有更高的阳性检出率[35]。

3.2 猪流行性腹泻病毒检测

猪流行性腹泻病毒（PEDV）于1971年在欧洲首次发现，传遍欧洲后又先后传播到了东亚和美国，这种疾病给全球养猪业造成了巨大的经济损失。猪流行性腹泻病毒的检测方法包括临床观察，组织学观察，中和试验， 免疫荧光和免疫组织化学，但这些方法都耗时太长而且不适合做高通量检测。而qPCR法因为需要建立标准曲线容易引起检测结果的偏差。暨南大学和河北农业大学的研究人员联合开发了一种数字PCR方法来检测猪流行性腹泻病毒，检测下限达到了0.26 拷贝/微升，检测灵敏度是qPCR法的5.7倍[36]。

3.3 伪狂犬病毒检测

伪狂犬病病毒[PRV]是一种常见的疱疹病毒，它可以导致猪的流产、呼吸窘迫、神经系统紊乱和仔猪死亡，对中国养猪业具有重要的经济影响[37]。传统的伪狂犬病病毒检测方法包括病毒的分离培养和抗体的血清学检测，这些方法结果可靠但耗时长而且对操作的要求高[38,39]。四川农业大学的Ren, Meishen等人开发的双重数字PCR检测方法可以同时检测野生型毒株和注射疫苗后产生的基因缺陷型毒株[40]，实验结果显示，该方法的灵敏度是qPCR法的16倍并且具有很好的可重复性和稳定性。这个双重数字PCR伪狂犬病毒检测方法不但可以高灵敏的检测到伪狂犬病毒，而且可以准确评估注射疫苗后的效果，为疫苗的开发和施打策略提供参考依据。

4 数字PCR技术在植物检疫中的应用

4.1 瓜类果斑病菌检测

瓜类果斑病菌可以引发瓜类的细菌性果实斑点病[41]，自1987年首次在西瓜中发生细菌性果实斑点病以来，它已成为瓜类作物生产的严重威胁[42]。瓜类果斑病菌主要通过种子传播[43]，因此，种子的检测对病害管理具有重要意义。北京农林科学院的Yu Lu等人开发了基于数字PCR的检测方法[44]，他们以培养的病菌和提取的DNA为样本比较了数字PCR和qPCR法的检测下限的，数字PCR法的灵敏度是qPCR的10倍。然后他们又以201份未知的西瓜和香瓜、商业种子为待测样本，对比了两种分子方法和平板培养法的检出阳性样本数，结果显示数字PCR是平板培养法检出阳性样本数的2.6倍；是qPCR检出阳性样本数的12倍。

4.2 马铃薯病毒检测

植物病毒的量化对于监测感染的进展，以及病毒在一个季节的时间内不同植物组织中的滴度变化非常有用[45]，它为流行病学研究和优化诊断抽样提供了重要信息依据。此外，病毒量化在研究植物对病毒感染的反应中涉及的代谢途径的基因功能方面也很重要[46]。然而，马铃薯病毒这类RNA病毒有较高的突变率，造成引物探针对不同序列的模板的扩增效率不同，这给病毒的核酸检测特别是准确定量带来了困难。数字PCR是对单个微滴中的单个模板进行扩增和终点法计数，定量结果不受扩增效率的影响。基于这个原理，斯洛文尼亚国家生物研究所的Mehle等人开发了数字PCR马铃薯病毒检测方法，他们以3种不同基因型的毒株为模板比较了数字PCR和qPCR法的检测灵敏度[47]。结果显示，这两种方法对其中一种基因型毒株的检测灵敏度接近。对于其它两种基因型的毒株，数字PCR的检测灵敏度都是qPCR的10倍。此外，研究者还以数字PCR定量的核酸为标准品，比较了3组qPCR的引物探针，结果证明数字PCR可以用来校准qPCR法的检测结果。

5 数字PCR技术在动物源检测中的应用

肉类掺假已经成为了一个世界范围的问题，涉及食品和饲料行业，此外，皮毛、奶酪等动物制品也是掺假的高发区。它虽然不会对消费者的健康直接造成危害，但用廉价原材料进行替代或掺假，为不法食品提供了一条诱人的捷径并且带来了潜在的公共健康风险。因此,发展一种准确可靠的测定特定肉类成分含量的方法 在食品方面具有重大的经济意义和深远的社会意义。相比蛋白，脂类等其它生物物质，DNA更加稳定，即使经过加工，形态发生变化，部分样本受损，DNA序列信息也不会改变，不会影响检测结果；而且DNA存在于生物的任何组织部位，取样更加方便，也具有更高的种属特异性，这使得包括分子杂交、PCR、荧光定量PCR（qPCR）、多重PCR、数字PCR和等温扩增等技术被广泛应用于肉类的动物源检测中。其中数字PCR以其精准可靠、对样本类型适应度高、适合开发多重检测的特点，不仅可以准确判断动物源成分是否存在掺假还可以对掺假成分进行精确定量。

5.1 区分牛、马和猪源成分

线粒体基因CYTB广泛存在于所有哺乳动物细胞中并且有较高的拷贝数，因此在很多研究中被用来作为物资鉴定的靶标[48-50]。德国哥廷根大学的Floren等人在开始开发数字PCR动物源检测方法时也选择了CYTB基因作为靶标，但实验结果显示CYTB基因在不同组织（脂肪和肌肉）之间至少有5倍的差异，不适合用来作为动物源检测和定量的靶标。因此，他们选择以核基因F2为靶点的开发了数字PCR动物检测方法，以小牛肝香肠、肉制品、冷冻肉为样本检测了灵敏度。结果显示，这个方法区分牛、马和猪源成分的定量下限达到了0.01%，检测下限达到了0.001%[51]。

5.2 开发检测鸭源成分标准品

因为鸭肉的价格相对较低，经常被不法商贩掺入或者直接当作其它肉类销售。市场上非常需要灵敏可靠的检测产品。浙江省农科院和中国农科院的研究人员以interleukin 2基因为靶点，在数字PCR平台上开发了检测鸭源成分的标准品[52]。在标准品的开发过程中，8个独立的诊断实验室通过数字PCR对这些鸭子的基因组标准物进行了检验和认证，结果具有很好的一致性，确认IL2基因的平均拷贝数为5.78±0.51×103拷贝/μL。同质性和稳定性测试表明，在-20℃存储和冷链交付条件下，标准品在至少6个月内是均匀和稳定的。这个标准品可作为肉制品中鸭含量分析方法的验证和性能测试的必要工具。这个研究也为其他动物源性参考物质的开发提供了技术基础。数字PCR绝对定量、重复性好的特点发挥了至关重要的作用。

5.3 羊肉中鸡源成分的检测

大量的研究用qPCR法来定量动物源成分[53-56]。然而，利用实时PCR的Ct值计算的拷贝数会受到扩增效率和DNA溶液中杂质的影响。与实际拷贝数的差异会导致不同物种重量比例的量化有较大偏差。中国农业大学和中国检验检疫科学研究院的研究人员在数字PCR平台上开发了鸡源成分的检测方法，并检验了该方法在羊肉样本中检测鸡源成分的灵敏度、精确性和稳定性[57]。结果显示，该方法的定量下限为1%，检测下限为0.1%。与qPCR相比，在鸡源成分比例5% ～ 80%范围内的偏差降低9%。此外，鸡肉的部位对定量的准确性没有影响，而且在不同的压力和温度条件下，可以保持较高的精确度。

6 数字PCR在转基因产品检测中的应用

农作物转基因技术在提高粮食产量、提高农作物抗性、改善农产品品质等方面发挥了巨大的作用，但同时也引起了生物安全和消费者安全的担心。目前qPCR被用来检测转基因植物并展现了较好的灵敏度和特异性。然而，当转基因靶点核酸在样品中占比较小时，扩增检测会被大量非靶点核酸干扰，对转基因靶点的量化会受产生严重的偏差。另一个重要的限制是qPCR对从复杂基质中核酸提取物中抑制剂的高敏感性。数字PCR因为是把单个核酸模板隔离后进行扩增检测，从而避免了其它非靶点核酸的干扰，同时也大大降低了核酸提取物中抑制剂对反应的干扰。因此，人们对在数字PCR平台上进行转基因植物检测进行了充分的研究和开发。转基因植物产品的数字PCR 检测方法也被写入了我国海关的行业标准。

6.1 双重数字PCR定量转基因克螟稻

中国农业科学院的Li Jun等人，以水稻中的单拷贝基因磷脂酶D基因为参考开发了检测克螟稻的双重数字PCR方法[58]。该方法的检测下限达到了9拷贝，定量下限达到了34拷贝。研究者还对比了qPCR和单重数字PCR法，虽然三种方法都能在规定的范围内检出转基因物质并给出合格的转基因拷贝数，但双重数字PCR法的不确定区间最窄，精准度最好。

6.2 转基因玉米的绝对定量

各个国家判定农产品是否为转基因产品的标准基本都以所转的基因与内源性基因之间的拷贝数比为评判标准，因此需要一种灵敏度高并且可以精确定量的检测方法给出评判的参考。qPCR法目前被用于转基因生物的定量，但它在检测低拷贝DNA靶点方面的局限性导致人们去开发新的检测方法。欧洲标准局的Corbisier等人建立了一种数字PCR检测MON810基因和内源性高迁移群蛋白A基因的方法[59]，数字PCR测定的绝对拷贝数之比和使用了质粒DNA校准的qPCR测定的绝对拷贝数之比相同。与qPCR法相比，数字PCR不需要质粒DNA进行校准，具有更好的可重复性，更适合用来检测所转的基因与内源性基因之间的拷贝数比。

7 总结和展望

数字PCR基于“ 模板有限稀释 ”和“ PCR反应体系离散独立扩增 ”的技术原理，为海关检验检疫提供了一种能够绝对定量且灵敏度、精度、特异性、抗干扰性更佳的核酸检测技术。综上所述，数字PCR技术的使用能够进一步提高国境卫生检疫、动物病原菌检疫、植物病原菌检疫、动物源性成分检测及转基因产品检测等方向的结果的准确性与可靠性。

虽然数字PCR已被证实相比于传统核酸检测技术具有更多的优势，但距离其真正广泛应用于海关检验检疫，还有以下挑战需要克服（1）由于样本量大及检验人员人数有限，海关对于操作的简便性与技术自动化程度有一定要求，目前商用的数字PCR系统的自动化程度还需进一步提高；（2）数字PCR的仪器和耗材成本较传统的PCR检测技术高，因此制约了其进一步的使用，需要通过量产及原材料成本控制等手段来进一步降低使用成本；（3）由于海关检验检疫的项目较多，这就要求数字PCR企业开发更多元的检测试剂盒来满足海关检测各个项目的需求。

目前已有多家国内数字PCR企业投入研发自动化的一体机，相信随着稳定、高性能、低成本的数字PCR系统的面市，能够进一步推动数字PCR技术在海关系统的应用，提供更快速、准确的检测结果。