重组胶原蛋白的生物医学应用与发展前景★

周羽晗，袁榕穗，蒋受军，段玉林，边贺东

（1.广西民族大学化学化工学院，广西 南宁 530007；2.广西壮族自治区食品药品审评查验中心，广西 南宁 530021）

胶原蛋白是一种重要的结构蛋白，是许多生物体体内最丰富的蛋白质之一。胶原蛋白的主要功能是提供机体的结构支撑，维持组织的稳定性和弹性[1]。在组织和器官中，胶原蛋白主要存在于骨骼、关节、肌肉、皮肤、血管、角膜等组织中。此外，胶原蛋白还能作为一种信号分子参与调节细胞的增殖、分化和迁移，对于维持正常的生理功能和机体的整体健康具有重要的作用[2]。

胶原蛋白在医学、保健和美容领域具有广泛的应用。在医学领域，胶原蛋白被广泛应用于组织工程和再生医学，用于修复组织缺损和创伤[3]；在保健领域，胶原蛋白被用于预防和治疗关节炎、骨质疏松等疾病；在美容领域，胶原蛋白被广泛应用于护肤、美容、减肥等方面。

总之，胶原蛋白对于机体的正常生理功能和健康具有重要的作用，重组胶原蛋白的应用不仅可以改善人类健康和生活质量，还可以促进医疗保健和美容产业的发展，带动相关产业链的发展，形成新的经济增长点。对于胶原蛋白的研究和应用具有重要的意义。

1 重组胶原蛋白的背景和发展历程

1.1 重组胶原蛋白的背景

胶原蛋白是一种在人体内广泛存在的结构蛋白质，它在维持人体组织形态、保持身体健康方面起着非常重要的作用。但是，受到人体的生理和外部环境等因素的影响，胶原蛋白可能会受到破坏和损伤，导致身体各种组织器官的功能受到影响，甚至引发一些疾病。因此，对胶原蛋白的重组研究具有非常重要的意义[4]。

1.2 重组胶原蛋白的发展历程

初期研究阶段：20 世纪50 年代至70 年代初期。人们开始对胶原蛋白的分子结构和生物学特性进行研究，但受到技术限制，研究进展缓慢。70 年代初期，人们开始尝试通过体外重组的方式来制备胶原蛋白。但是，由于制备过程中需要大量的胶原蛋白和高昂的成本，以及技术限制，这一阶段的研究成果有限[4]。

基因工程技术应用阶段：20 世纪80 年代至90 年代初期。这一阶段，随着基因工程技术的发展，人们开始尝试通过重组DNA 技术来制备胶原蛋白。通过基因工程技术[4]，可以将目标基因插入到表达载体中，并在表达宿主中表达目标蛋白质。这一阶段的研究取得了重要进展，使得胶原蛋白的体外重组成为可能。此外，还发展了多种重组胶原蛋白表达系统，并对重组胶原蛋白的结构和生物学性质进行了深入研究。

应用拓展阶段：21 世纪初至今。随着生物技术和纳米技术的不断发展，重组胶原蛋白的应用领域得到了广泛拓展[4]。

2 重组胶原蛋白的制备和检测方法

2.1 重组胶原蛋白的制备方法

2.1.1 基于原核表达系统的制备方法

唐云平等通过在大肠杆菌中将类人胶原蛋白基因与人脯氨酰-4-羟化酶（P4H）和D-阿拉伯-1，4-内酯氧化酶（ALO）共表达，构建了一个原核表达系统来生产羟基化类人重组胶原蛋白，并且研究了5 种不同的培养基以及诱导条件对该蛋白可溶性表达的影响。该方法制备周期短、成本低，适用于制备规模较小的重组胶原蛋白。但由于重组胶原蛋白的复杂性较高，可能会存在结构和功能的问题。重组胶原蛋白传统提取法生产主要是利用酸、碱水解法从羊皮、牛皮、鱼、猪皮等中提取，由于蛋白质的复杂性较高提取过程中会或多或少丧失其部分的生物活性，并且提取产品成分非常复杂。文献中提到大肠杆菌表达系统还具有原核表达系统的翻译后的加工修饰体系不完善、产生的致热原使胶原蛋白难以应用于临床等,也使得表达产物的生物活性较低。此外，国外虽然早就在真核系统中表达出多种胶原蛋白，但很少有在原核表达系统中对胶原蛋白或其片段进行表达的报道，所以这也是我们需要努力的方向。

2.1.2 基于真核表达系统的制备方法

该方法可以制备较高质量的重组胶原蛋白，并且可以实现蛋白质的复杂修饰。构建含有Ⅵ型胶原蛋白基因的真核表达载体，并使其在毕赤酵母中的分泌表达，为深入研究Ⅵ型胶原蛋白的活性功能及其生产奠定基础。漆佳丽等构建鼠Ⅰ型胶原蛋白α1 链（COL1A1）C 端甘氨酸重复序列的真核表达载体，探究其与成纤维细胞(Rat-1)的相互作用。为研究Ⅰ型胶原蛋白在成纤维细胞表面上的受体复合物奠定了基础。

2.1.3 基于化学合成的制备方法

本法提供了一条快速、高效的蛋白质制备途径，同时它能方便地引入非天然氨基酸改变碳链骨架以及进行其他化学修饰来提高蛋白质活性构建新的蛋白。Kumar V 等利用36 个氨基酸残基胶原，模拟多肽自组装设计胶原纳米纤维，研究发现，自组装胶原纳米纤维具有三螺旋结构，这种人工合成仿生胶原纤维具有促进愈合的作用，可用于止血。但它也有缺点：成本较高，需要较高的技术水平和设备条件，同时蛋白质的修饰也存在一定限制。

2.2 重组胶原蛋白的检测方法

2.2.1 SDS-PAGE 法

何越等用SDS-PAGE 方法对微生物发酵并经纯化获得的胶原蛋白进行电泳鉴别，上样质量浓度为1 g/L，上样量10 μL，同时点样Marker，样品直接恒压90 V 跑到底，之后采用染色液染色1 h，脱色液处理3 h，观察电泳条带情况。纯化后获得的重组胶原蛋白具有较高的纯度，表达量高说明所用的发酵体系胶原表达高效、稳定。该方法操作简单，成本低，所以取发酵上清液做SDS-PAGE 鉴定，培养基1 中目的蛋白表达量最高，条带最粗，说明此培养基蛋白质含量最高。同样为探究目的蛋白表达的最适甲醇诱导浓度，同理制备SDS-PAGE 电泳样品电泳检测，使用凝胶成像软件分析表明甲醇诱导质量分数在0.5%时目的蛋白表达量最高，条带最粗。那治国等为了检测胶原蛋白的结构运用SDS-PAGE 观察图谱，一条在α 链97.2 kDa 处，另一条在116 kDa 附近出现两条条带，由链和链泳带颜色的深浅及光密度可以大致推断两者含量，由此推断胶原蛋白分子是由两条相同的链和一条不同的链组成的异源三聚体结构。但该方法不能对重组胶原蛋白的完整性进行判断。

2.2.2 圆二色谱法

文献中提到使用蛋白质溶液的圆二色谱可以反映出蛋白质的立体结构信息，得到数据后胶原三螺旋结构特征性参数为正吸收峰与负吸收峰的比值，胶原蛋白的三重螺旋结构完整性与比值呈正相关，所以说明三重螺旋结构完整。此文献作者将该蛋白样品按照终质量浓度250 mg/mL 溶解于Tris-HCL 溶液后，经圆二色谱检测，观察峰的高低变化找到明显的吸收峰区得到胶原蛋白的氨基酸残基中极少含有芳香族氨基酸。但是该方法的成本较高，需要较高的技术水平和设备条件，蔡思泽在研究人源Ⅲ型胶原蛋白时，pPIC9K-COL3-4 菌株的发酵液进行Western Blot 验证，在预期42 kDa 位置附近有明显条带，表明双串联胶原蛋白在毕赤酵母中能够成功表达，且能分泌到胞外，但该方法需要特定的抗体，且操作较为繁琐。

总的来说，选择合适的方法取决于所需的量和质量、设备条件、操作时间和成本等因素。

3 重组胶原蛋白的纯化

常见的重组胶原蛋白质纯化技术包括柱层析其核心是样品中的不同组分在固定相和流动相中的分配系数不同，各组分随着流动相的移动而在两相中进行不断的分配。其种类主要分为亲和层析、离子交换层析、疏水作用层析以及凝胶层析4 方面。蔡思泽等通过SDS-PAGE 和western-blot 方法检测目的蛋白的表达，并根据表达量筛选高产菌株。在此基础上，通过硫酸铵沉淀、亲和层析纯化重组胶原蛋白，进而研究了重组胶原蛋白的抗氧化活性。并通过电镜观察胶原蛋白的结构，为胶原蛋白的应用奠定一定基础。潘明利通过大肠杆菌发酵的方式来表达重组胶原蛋白，并通过镍离子柱亲和层析及随后的蛋白质透析的方法对获得的重组胶原蛋白进行分离和纯化。为了尽可能采取最少的工艺步骤，来获得最大的回收率。朱少瑜用毕赤酵母表达重组人白细胞介素11（rhIL-11）的纯化生产工艺和以特宝rhIL-11（特尔康）的纯化生产工艺为对比，其结构和性质是相同的。王皓等使用柱层析技术在重组试验采用Ni Sepharose6Fast Flow 树脂亲和层析进行纯化，取收集的洗脱液进行SDSPAGE 电泳，并用洗脱Buffer 做空白对照，纯化后得到了目的蛋白经软件分析可知其纯度＞90%，为重组胶原蛋白的大规模生产应用奠定基础。此外，纯化时费用偏高，纯化费用占总生产成本的20%～30%。因此，在进行蛋白纯化工艺的设计时，应根据自己实际情况来选择合适的柱层析种类。

4 重组胶原蛋白的多方面应用

重组胶原蛋白可以作为皮肤再生和修复的生物材料，用于治疗各种皮肤损伤和疾病，如烧伤、创伤、疤痕、痤疮等。它可以促进皮肤细胞的增殖和分化，促进皮肤的再生和修复，改善皮肤的外观和质量。刘讲娇研究重组胶原蛋白贴敷料将其应用于术后皮肤修复使皮肤屏障功能、创面恢复时间、舒适度这几方面取得了一些实际效果，并在酵母重组胶原蛋白贴敷料中加入甘油能够增加敷料的黏性，可提升患者舒适度。

重组胶原蛋白可用于骨折愈合、关节置换、脊柱融合等骨科手术中，促进骨细胞的增殖和骨组织的形成。张珊珊构建大鼠5mm 颅骨缺损模型，采用CT、MRI 等仪器对颅骨缺损模型进行分析观察，结果表明重组胶原蛋白CL 有望作为一种生物医用材料用于骨修复。重组胶原蛋白作为一种生物材料，在组织工程和再生医学领域中具有广泛的应用。另外，重组胶原蛋白还可以作为心肌修复的支架材料，用于心肌缺血和心肌梗死的治疗。Yang 等利用重组Ⅲ型胶原蛋白制备三维多孔支架及水凝胶材料已被应用于医学组织工程领域的应用研究中。

组织工程是一种利用生物材料、生物活性分子和细胞等技术，构建组织和器官的新方法。曾斐鸿[5]进行了重组Ⅳ-α1 蛋白理化性质的初步探究,为重组胶原蛋白Ⅳ-α1 应用于组织工程材料打下坚实的基础。重要的是，这是首次通过HEK293F 细胞瞬时表达系统实现了胶原蛋白Ⅳ-al 编码区全长序列的分泌表达，为重组胶原蛋白Ⅳ-al 应用于工业化生产和组织工程材料拉开了序幕。再生医学是一种利用生物学和工程学的原理和方法，通过激发和促进组织、器官或整个身体的自我修复和再生能力，治疗各种疾病的新兴医学领域。李伟娜等为提高重组毕赤酵母发酵重组人Ⅲ型胶原蛋白产量，采用响应面对其生长阶段的BMGY 培养基组成进行优化。通过Placket-Burman 试验使该重组胶原蛋白对大鼠乙酸灼伤胃黏膜有明显修复作用,为生物医用材料的应用制备奠定了基础。

总之，重组胶原蛋白在组织工程和再生医学领域中具有广泛的应用前景，有望为众多临床医疗问题提供有效的解决方案。

5 未来展望和挑战

随着人们对生活品质和健康水平要求的提高，重组胶原蛋白在生物医学和生命科学领域的应用前景更是不可限量。但是在应用过程中也面临一些挑战和问题。其中最主要的挑战是如何解决重组胶原蛋白的稳定性和成本问题。重组胶原蛋白在制备和储存过程中易受到热、光、pH 等因素的影响而发生变性或降解，从而导致其性质和功能的损失。此外，重组胶原蛋白的制备成本也较高，需要进一步降低成本以推广其应用。

为了解决这些问题，科学家们正在开展一系列的研究。研究人员正在探索使用表面改性、交联和包覆等手段来提高重组胶原蛋白的稳定性。同时，新的生产技术，如分子印迹、发酵技术等，也被引入到制备过程中，以提高产量和降低成本。

此外，也有研究人员探索使用合成材料替代天然的胶原蛋白。这些合成材料具有更好的稳定性和可控性，同时具有良好的生物相容性，可以有效地替代胶原蛋白在生物医学领域的应用。