蒙脱石对仿刺参幼参生长、主要消化酶和免疫酶活性的影响

2023-02-02李君华刘佳亮孙路平刘石林王玉本

水产科学 2023年1期

李君华，刘佳亮，李静，孙路平，刘石林，王玉本

( 1.山东东方海洋科技股份有限公司，国家海藻与海参工程技术研究中心，山东烟台 264003； 2.中国科学院海洋研究所，山东青岛 266071 )

蒙脱石是一类硅铝酸盐矿物，含有多种常量元素和微量元素及生物活性物质，具有良好的吸水性、膨胀性、分散性和离子交换性等特性，还具有无药物残留、无耐药性、无激素和无腐蚀性等优点。蒙脱石可通过物理和化学方法对其表面基团和电荷的分布进行适当的改性，提升蒙脱石的吸附性能，杀菌和脱毒效果更好[1-3]。蒙脱石可吸附动物肠道中的霉菌毒素、重金属、细菌等，修复和保护消化道黏膜，防治腹泻[4-5]；还可吸附饲料中的霉菌毒素，延长饲料的保质期，提高饲料适口性[6-7]。另外，蒙脱石含有的多种矿物质元素是动物体内各种新陈代谢过程和骨骼建造的不可缺少的成分，是酶、激素等生物活性物质的组成成分，并影响其活性或免疫反应等，且以离子和可溶性盐的形式存在，利于动物吸收[8]。

蒙脱石已在禽畜业和环保方面得到了广泛应用，并有大量的研究报道[8-12]，在饲料脱霉、治疗动物腹泻和提高生产性能等方面有显著的效果，如：在断奶仔猪基础日粮中添加载铜蒙脱石可提高仔猪日增加质量和饲料利用率，促进仔猪生长[9]；改性蒙脱石可通过抗氧化、抗炎和抗凋亡功能等途径降低仔猪腹泻，并促进其生长[10]；蒙脱石还可缓解黄曲霉毒素B1污染的饲粮对肉鸡引起的不良影响[12]。其在渔业方面的使用研究报道却很少，如：蒙脱石可有效地促进鱼虾机体代谢，提高抗病力和生长率等[13-14]；载铜蒙脱石对水产病原菌具有抑制和杀灭作用[15]；Hu等[16]发现，添加0.15%的载铜蒙脱石可提高尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的生长。蒙脱石优良的吸附性能可降低水体中硫、重金属等离子的含量，吸附池底腐败有机物，改善养殖水环境[17]。

仿刺参(Apostichopusjaponicus)作为我国重要的海水养殖种类，存在种质退化、养殖环境恶化等问题，许多学者以仿刺参饲料优化和微生态制剂研发作为切入点进行研究[18-19]。笔者将蒙脱石作为饲料添加剂，以期增强仿刺参消化性能和免疫能力，进而促进仿刺参生长，并获得蒙脱石最适添加量，为蒙脱石在仿刺参养殖中的应用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

试验用基础饲料来自山东东方海洋科技股份有限公司，其主要成分为马尾藻(Sargassumpolycystum)、鼠尾藻(S.thunbergii)、羊栖菜(S.fusiforme)、脱胶海带(Laminariajaponica)、豆粕、次粉等，粗蛋白含量为19.84%，粗脂肪含量为 4.28%。高纯度纳米蒙脱石由赤峰市恒润工贸有限公司生产(纯度95%)，以基础饲料为对照组，在基础饲料中添加0.20%、0.40%、0.60%和0.80%的蒙脱石作为4个处理组。

1.2 仿刺参来源及日常管理

试验仿刺参选自山东东方海洋科技股份有限公司海参育苗车间，初始体质量(1.37±0.07) g。试验容器为100 L的蓝色塑钢水箱，每个水箱45头仿刺参，每个试验组随机分配3个水箱。养殖期间，盐度29.0±1.0，水温15.8～21.0 ℃，保持24 h充氧，日换水约50%，换水时收集粪便并清理残饵，保持水箱内清洁。日投饵量为仿刺参体质量的3%～5%，基础饲料与海泥以1∶1(质量比)混合投喂，投喂前过100目筛绢。仿刺参暂养7 d，停食2 d后开始试验，试验周期为75 d。

1.3 样品采集与分析

1.3.1 样品采集及处理

试验结束时称取仿刺参体质量，停食72 h后，解剖仿刺参取肠道和体腔液。每个水箱随机抽取6头仿刺参，使其排空消化道内的食物残渣，用滤纸轻轻吸干体表水分，逐头称量质量，置冰盘上，用解剖刀沿仿刺参泄殖腔剖开0.5 cm，立即置于准备好的10 mL离心管上方收集体腔液，于4 ℃，4000 r/min(离心半径10 cm)离心10 min，取上清液分装于0.5 mL离心管中，-80 ℃保存，用于测定各项免疫指标。待仿刺参体腔液取样完毕，取出仿刺参消化道，剔除与消化道末端相连的呼吸树，用预冷重蒸水配制的pH 7.0磷酸盐缓冲液(Na2HPO4-NaH2PO4)冲洗后，用滤纸轻轻吸干水分，称量肠道质量，-80 ℃保存，用于测定肠道消化酶活性。

肠道粗酶液的制备：仿刺参消化道在冰浴中用玻璃研磨器匀浆10～15 min，按1 g样品10 mL缓冲溶液的比例分次加入pH 7.0的磷酸盐缓冲液。然后将匀浆液在高速冷冻离心机中以4 ℃，5000 r/min(离心半径10 cm)冷冻离心30 min，其上清液即为粗酶提液，4 ℃保存。24 h内分析完毕。

1.3.2 测定指标

仿刺参生长指标按下式计算：

RSG=(lnmt-lnm0)/t×100%

式中，RSG为特定生长率(%/d)，m0和mt分别为初始体质量和试验t时间的体质量(g)，t为试验时间(d)。

仿刺参饲料干物质表观消化率计算方法如下：

R=100%-(100%×Adiet/Afeces)

式中，R为干物质表观消化率(%)，Adiet和Afeces分别为饲料和粪便中酸不溶性灰分含量。

参照文献[20]的方法测定幼参肠道蛋白酶和淀粉酶活性。采用南京建成生物工程研究所生产的蛋白质定量测定试剂盒(考马斯亮蓝法)测定粗酶液蛋白质浓度。体腔液的超氧化物化酶、溶菌酶和碱性磷酸酶的活性均用南京建成生物工程研究所生产的相关试剂盒测定，操作步骤按试剂盒说明书进行。

1.4 数据分析

试验数据采用平均值±标准差表示，采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，比较组间差异显著性采用邓肯多重比较，以P<0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 饲料中添加蒙脱石对仿刺参生长性能及干物质表观消化率的影响

饲料中添加蒙脱石对仿刺参生长性能的影响见表1，仿刺参的存活率为(88.67±2.31)%～(90.00±2.00)%，添加蒙脱石对仿刺参存活率无显著影响(P>0.05)。添加蒙脱石提高了仿刺参特定生长率，随着蒙脱石添加量的增加，特定生长率呈先升后降的趋势。其中以添加量0.40%组最高，达(1.03±0.16)%/d，其次为0.20%组，均显著高于对照组(P<0.05)。

蒙脱石显著提高了仿刺参干物质表观消化率(P<0.05)(表1)，其随着蒙脱石添加量的增加而降低。其中，0.20%组最高(35.09±1.15)%，其次为0.40%组，两组间差异不显著(P>0.05)，均显著高于其他各组(P<0.05)。

表1 饲料中添加蒙脱石对仿刺参生长性能及干物质表观消化率的影响(平均值±标准差，n=3)

2.2 饲料中添加蒙脱石对仿刺参肠道蛋白酶和淀粉酶活性的影响

饲料中添加蒙脱石对仿刺参肠道蛋白酶和淀粉酶活性的影响见表2，添加0.20%～0.60%的蒙脱石显著提高了仿刺参肠道蛋白酶和淀粉酶活性(P<0.05)，随着蒙脱石添加量的增加呈先升后降的趋势。添加0.40%的蒙脱石仿刺参肠道蛋白酶和淀粉酶活性最高，分别为(73.27±3.73) U/mg和(70.63±1.96) U/mg，较对照组分别提高 39.30% 和30.68%；添加0.80%的蒙脱石对仿刺参肠道蛋白酶和淀粉酶无显著影响(P>0.05)，但低于对照组。

表2 饲料中添加蒙脱石对仿刺参幼参肠道蛋白酶和淀粉酶活性的影响(平均值±标准差，n=3) U/mg

2.3 饲料中添加蒙脱石对仿刺参体腔液非特异性免疫酶活性的影响

饲料中添加蒙脱石对仿刺参体腔液非特异性免疫酶活性的影响见表3，不同添加量的蒙脱石对仿刺参体腔液免疫因子超氧化物歧化酶、溶菌酶和碱性磷酸酶活性有不同程度的影响，其中，对仿刺参体腔液中溶菌酶活性的影响最大。添加 0.20% 和0.40%的蒙脱石显著提高了仿刺参体腔液中超氧化物歧化酶活性(P<0.05)，0.60%组和0.80%组蒙脱石对仿刺参体腔液超氧化物歧化酶活性无显著性影响(P>0.05)，组间无显著性差异(P>0.05)；添加0.20%～0.80%的蒙脱石显著提高了仿刺参体腔液溶菌酶活性(P<0.05)，以0.60%组最高(20.72±1.05) U/mL，较对照组提高50.04%；添加0.40%～0.80%的蒙脱石显著提高了仿刺参体腔液碱性磷酸酶活性(P<0.05)，以0.40%组最高(0.195±0.016) U/mL，较对照组提高44.42%。

表3 饲料中添加蒙脱石对仿刺参幼参体腔液中免疫酶活性的影响(平均值±标准差,n=3) U/mL

3 讨论

3.1 饲料中添加蒙脱石对仿刺参生长和干物质表观消化率的影响

蒙脱石是一种新型的饲料添加剂，它可降低饲料通过消化道的速度，促进饲料在胃肠中的消化吸收，提高饲料的转化利用率，降低成本；它还能提高饲料的适口性和改进饲料的松散性，并明显延长饲料的保质期等[6-7]。蒙脱石在家禽生产中作为饲料添加剂使用，可提高家禽生产性能和产品品质[21-22]；蒙脱石在水产养殖行业中，通常用于养殖虾池，能起到调节、补充水产养殖中微量元素的作用，可有效地促进鱼虾类机体代谢，防病抗病，提高成活率[17]。胡彩虹等[13,16]比较系统地报道了饲料中添加载铜蒙脱石对罗非鱼生长和肠道菌群的影响，添加0.15%载铜蒙脱石提高了罗非鱼肠道屏障功能、饲料转化率和饲料养分表观消化率。本试验中，添加0.20%～0.40%的蒙脱石可显著提高仿刺参特定生长率，添加0.40%的蒙脱石仿刺参特定生长率最高，最适添加量较尼罗罗非鱼[16]的最适载铜蒙脱石添加量(0.15%)偏高，这可能与仿刺参滤食性和肠道构造简单有关，且用于尼罗罗非鱼的为载铜蒙脱石。添加0.80%的高剂量蒙脱石仿刺参特定生长率有所降低，添加量过高不利于仿刺参生长，可能因蒙脱石遇水会形成团样的黏稠结构，减缓了饲料在肠道内的流通速度，导致仿刺参产生物理饱感。

消化率是评价饲料效果的重要指标。Seo等[23]研究表明，仿刺参对配合饲料的干物质表观消化率为36%～63.9%，其配合饲料中主要是藻粉、豆粕、面粉等易被消化吸收的原料。Xia等[24]以海藻粉和海泥3∶7(质量比)的比例投喂仿刺参，海泥比例较大，饲料干物质表观消化率不高，不同藻粉干物质表观消化率为9.63%～15.84%。本试验中海泥与基础饲料投喂比为1∶1(质量比)，基础饲料中亦含有藻粉、豆粕、次粉等易消化的原料，仿刺参对饲料的干物质表观消化率为29.94%～35.09%，介于两者之间。已有研究表明，在饲料中添加蒙脱石可促进营养物质的消化[25]，蒙脱石可延长食物通过消化道的时间，改善肠道菌群和肠黏膜形态，提高饲料的利用率。本试验中，添加蒙脱石显著提高了仿刺参饲料干物质表观消化率，添加量过大会影响仿刺参对饲料的消化吸收，可能因蒙脱石中含有氧化钙等物质，影响饲料的适口性，这与过量的蒙脱石引起奶牛不适的情况[26]相似，也有报道称，蒙脱石会影响动物对赖氨酸、维生素B2的吸收[27]。

3.2 饲料中添加蒙脱石对仿刺参肠道主要消化酶的影响

蒙脱石含有大量矿物质元素及铜、锌、硒等多种微量元素，一方面可补充动物营养所需的矿物质，另一方面是酶、激素等生物活性物质的组成成分，具有促酶和催酶作用，易被动物吸收利用，从而促进动物的生长发育。郭彤等[11]报道，饲料中添加载铜蒙脱石能显著提高断奶仔猪十二指肠内容物中总蛋白水解酶、脂肪酶、淀粉酶的活性；胡彩虹等[13]认为，在饲料中添加0.15%～0.20%的载铜蒙脱石可提高罗非鱼肠组织蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性。通常仿刺参生长速率越快，其肠道消化酶的活性越高[28]，而蛋白酶和淀粉酶是仿刺参肠道的主要消化酶[20]。饲料中添加的蒙脱石吸水膨胀除降低了饲料经过肠道的速度外，还可吸附肠道内的病原菌，保护肠道黏膜，益于消化酶的分泌，添加0.20%～0.60%的蒙脱石显著提高了仿刺参肠道蛋白酶和淀粉酶活性，添加比例较罗非鱼的高，可能因两者的饲料形态不同，仿刺参饲料为粉状，泼洒于水中蒙脱石会有部分损失。

适量的蒙脱石可提高动物对饲料营养的消化吸收，高剂量的蒙脱石吸水后膨胀数十倍，更不易排出体外，饲料滞留时间会延长，长期高剂量饲喂会对动物肠道造成一定损伤，加重肠道负担[29]。刘国栋等[14]认为，在杂交鲟(Acipenserruthenus♂×A.baeri♀)饲料中添加5.0%的蒙脱石生长指标仍有所上升，但组织切片结果发现，蒙脱石添加水平≥2.5%时，对杂交鲟肝脏组织有较严重的损伤，添加5.0%的蒙脱石对肠道组织有严重的损伤。本试验中，高剂量的蒙脱石(0.80%)在仿刺参肠道内吸水膨胀，滞留时间延长，长期过量使用，易造成仿刺参肠道负担，影响肠道消化酶的分泌，其损伤机理有待于进一步研究。

3.3 饲料中添加蒙脱石对仿刺参部分免疫因子的影响

仿刺参的防御机制主要是通过细胞免疫和体液免疫，还可产生一些抗氧化酶类来提高自身免疫力及维持免疫平衡。而蒙脱石起作用取决于它的吸附性能和胶凝特性：蒙脱石吸附于消化道黏膜并吸附固定病原微生物，使其破裂、脱水以至灭活，平衡正常菌群，提高消化道的免疫功能；同时在肠道中吸附其所产生的毒素，随粪便排出体外，消除病源，使机体处于有利环境中；另外，蒙脱石可与消化道黏液蛋白静电结合，增加消化道黏液量并改善黏液质量，提高黏液的内聚力和弹性，从而对消化道黏膜起保护和修复作用，抵抗外来致病因子的侵入[30]。唐小懿等[22]在断奶仔猪饲料中添加蒙脱石和酵母培养复合物，其显著提高了仔猪血清超氧化物歧化酶活性，提高了仔猪的免疫功能和抗氧化能力。杂交鲟饲料中添加1.0%的蒙脱石，血液呼吸爆发水平和血浆丙二醛含量达到最高，超过1.0%时，呼吸爆发水平不升反降，当达到5%时，高剂量的蒙脱石造成肝脏和肠道组织损伤及部分细胞破裂，导致血浆丙二醛含量上升[14]。本试验中，添加0.40%的蒙脱石仿刺参体腔液超氧化物歧化酶和碱性磷酸酶活性达到最高，仿刺参体腔液溶菌酶活性则在添加量达到0.60%时出现高值；仿刺参免疫水平达到较高水平后，随着蒙脱石添加量的增加逐渐下降，增加至0.80%时，仿刺参体腔液超氧化物歧化酶、溶菌酶和碱性磷酸酶活性下降，未出现上升情况。这与杂交鲟[14]的情况不同，可能0.80%蒙脱石的添加量仍未超出机体的承受范围，仅加重了仿刺参肠道负担，未出现组织损伤和体腔液免疫细胞破裂情况，仅影响了机体免疫水平的表达，表现为免疫力下降，仿刺参抗病能力减弱。