木薯MeMYC2.2基因耐低温功能研究

2023-02-02于晓玲李文彬李智博阮孟斌

生物技术通报 2023年1期

于晓玲李文彬李智博阮孟斌

（1 中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业农村部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室，海口 571101；2 海南热带农业资源研究院海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室，海口 571101）

木薯（Manihot esculentaCrantz）起源于南美洲，是世界上第六大粮食作物［1］，其最适生长温度为25-29℃［2］，低于10℃发育停滞［3］。低温条件下木薯发育迟缓、毒性物质累积，品质及产量都受到很大的影响［4］。因此木薯耐低温研究，对木薯产业发展具有重要的作用。

国内外目前对木薯低温响应的分子机理尚不清晰，研究主要集中在活性氧（reactive oxygen species,ROS）系统方面。增加ROS 的清除能力可以提高木薯对低温的耐受性［5-6］；Cheng 等［7］的研究表明，植物特异转录因子MeTCP4（teosinte branched/ cycloidea / PCF,TCP）的过量表达可以诱导ROS途径相关基因的表达，增强拟南芥对冷胁迫耐受性；过表达MeCu/ZnSOD和MeAPX2（ascorbate peroxidase,APX）提高活性氧清除能力，降低H2O2积累，提高转基因木薯对低温的耐受性［6］。另外，CBF3（c-repeat-binding factor,CBF）在木薯中过表达，可增强木薯对低温的耐受性［8］；干扰木薯MeMYB2的表达也可以提高木薯转基因植株对低温的耐受能力［9］。此外，也可以通过施肥提高木薯的抗寒能力［10］。

MYC2 转录因子是bHLH（the basic helix-loophelix）转录因子家族成员之一，其bHLH 保守结构域可与DNA 结合发挥作用［11］。近年来，在拟南芥、番茄、烟草、长春花、丹参等多种植物中对MYC2 基因进行了研究［12］，结果显示，MYC2 在植物应答逆境刺激时起重要调控作用，是茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号传导途径的核心调控元件，同时也是JA 通路与其他植物激素信号通路交互的关键节点［13］。赤霉素（gibberellin acid,GA）途径DELLA 阻遏物和JAZ 与MYC2 相互作用以抑制花中倍半萜的生物合成［14］；而脱落酸（abscisic acid,ABA）促进ABA 受体PYL6（pyrabactin resistance 1-like 6）与MYC2 的相互作用，并阻遏MYC2 与靶启动子的结合［15］；拟南芥MYC2 可能在EDR1（enhanced disease resistance 1）基因上游调控JA-SA（Sal Icylic acid）的信号互作［16］；苹果MdMYC2 与ERF3（ethylene response factor 3）启动子结合，调控乙烯生物合成［17］。低温及外源MeJA 可诱导香蕉MYC2 的表达，且MYC2可与ICE1（inducer of CBF expression 1）互作调节可香蕉的抗冻性［18］。

生产中木薯表现为对干旱具有良好的耐受性，但对低温敏感，但其分子机理尚不清楚。MYC2 在其他作物中表现出良好的抗寒作用，其在木薯中的作用尚未清楚。本研究通过前期低温转录组测序结果，发现MeMYC2 基因受低温胁迫诱导表达［19］。为进一步明确MeMYC2 基因的功能，本研究借助过表达木薯MeMYC2 基因的拟南芥，验证MeMYC2 影响低温耐受性的功能，旨在为进一步利用该基因提高栽培木薯对低温的耐受性提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥（Col-0）由中国热带农业科学院热带生物技术研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 木薯MeMYC2.2 基因的克隆利用TaKaRa 高保真酶（R045），以木薯cDNA 为模板，以特异性引物（表1）PCR 克隆木薯MeMYC2.2 基因［19］。PCR反应程序：98℃变性10 s，55℃退火 5 s，72℃延伸10 s，共计35 个循环。PCR 产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳回收纯化、与T 载体连接后转化大肠杆菌DH5α；经菌落PCR 及酶切鉴定为阳性克隆的，进行测序（上海生工）。所用引物及其序列如表1所示。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

利用NCBI Conservered Domain（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）预测基因序列的功能结构域；运用在线工具PI_tool（https://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）预测基因编码蛋白的分子量和等电点。

1.2.2 木薯MeMYC2.2 基因转录活性分析及亚细胞定位将MeMYC2.2 基因开放阅读框插入pGBKT7载体多克隆位点，并转化酵母Y187 感受态细胞。将鉴定为阳性的转化细胞与转化空白对照载体pGBKT7 的酵母菌液活化，浓度调整一致后，划线于SD/-Trp 平板（+40 μg/mL X-α-Gal），30℃倒置培养3-5 d 后，观察酵母显色情况。

利用XbaI 和BamH I 限制性内切酶，将MeMYC2.2 基因全长编码序列（不包括TGA 终止子）克隆到带有35S:GFP 植物表达载体中，形成35S:MeMYC2.2:GFP 融合表达载体。将上述重组质粒采用化学法分别转化到农杆菌LBA4404 中。将阳性克隆菌通过叶盘注射法瞬时转化烟草叶片。利用激光共聚焦显微镜（Olympus FV1000），在GFP 的激发波长（488 nm/505-550 nm）下检测荧光。

1.2.3 农杆菌介导的浸花法遗传转化拟南芥将携带有35S:MeMYC2.2:GFP 重组质粒的农杆菌LBA4404 菌株接种至LB 液体培养基中，28℃培养至OD600为1.0。短暂离心收集菌体，然后以悬浮液（MS培养基+60 g/L 蔗糖+0.02% Silwet）重悬菌体。选取生长旺盛、刚刚开花的拟南芥（Col-0），将花序浸入悬浮好的菌液中10 s，20℃保湿状态下过夜暗培养，然后恢复正常（22℃）光照培养1 周后，重复侵染1 次。待果荚成熟后，收获T0代种子。筛选压力（30 mg/L 潮霉素）下筛选T0代种子，获得T1代转化苗。随后T2代经3∶1 分离比筛选培养后，T3代获得单拷贝纯合植株，收取T3代纯合子种子备用。提取3 个T3代纯合转化株系叶片RNA，反转录后，qPCR 检测过量表达拟南芥株系中MeMYC2.2 基因的转录水平。

1.2.4 转基因拟南芥株系耐低温实验将筛选的转基因和野生型拟南芥种子表面消毒（75%乙醇+0.1% Triton X100，10 min）后，无水乙醇洗涤一次，超净工作台吹干种子，播种于1/2 MS 平板上，待长至四叶期，移栽于装有营养土（营养土∶蛭石=1∶2）的营养钵中，置于光照培养房中。待拟南芥叶盘铺开，进行低温（-20℃）处理。低温处理0、1、3 和6 h 后，取叶片于液氮中速冻后，置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.5 基因定量表达分析低温处理后的转基因及野生型拟南芥叶片，提取其总RNA，反转录成cDNA。进行目的基因检测及低温信号途径相关基因的荧光定量分析。以AtActin1为内参基因。

2 结果

2.1 木薯MeMYC2.2基因的克隆与生物信息学分析

木薯中有12 个MYC2 相似的基因，通过序列比对发现其中2 个（Manes.17G016000，Manes.15G-182700）基因与蓖麻、拟南芥、玉米等的MYC2 亲缘关系最近［19］。Manes.17G016000，Manes.15G182-700 分别命名为MeMYC2.1 和MeMYC2.2。采用在线生物信息学软件对其进行分析，结果如表2。NCBI在线预测蛋白保守功能域发现，MeMYC2.1 和Me-MYC2.2 都具有bHLH-MYC 保守结构域和HLH DNA结合域，属于典型的MYC 转录因子。

表2 MeMYC2 生物信息学分析Table 2 Bioinformatics analysis of MeMYC2

2.2 木薯MeMYC2基因表达模式分析

为探究木薯MeMYC2 在低温胁迫过程中的作用，我们对野生型木薯组培苗叶片在低温处理（10℃）不同时间段（0、12、24 和48 h）进行取材。提取叶片总RNA，并反转录合成cDNA 作为模板，利用实时荧光定量PCR 技术（RT-qPCR）对MeMYC2.1/2.2基因的表达量进行分析。结果表明，MeMYC2 基因的mRNA 在低温胁迫12 h 时丰度达到最高，随后逐渐降低，其中MeMYC2.2 的表达差异更明显（图1）。上述结果表明MeMYC2 为低温胁迫早期诱导基因，而MeMYC2.2 表达差异更显著。因此选择MeMYC2.2基因作为目标基因进行进一步研究。

图1 不同冷胁迫时间下MeMYC2 的表达分析Fig.1 Expression patterns of MeMYC2 under different cold stress（CS）time

2.3 MeMYC2.2可能作为转录因子在细胞核中行使功能

MeMYC2.2 蛋白定位预测分析显示其可能定位于细胞核。为验证MeMYC2.2 蛋白的亚细胞定位，本研究将MeMYC2.2 基因与GFP 进行融合后，构建相应的植物表达载体。利用烟草叶片瞬时转化系统验证蛋白的定位，在农杆菌转化、共培养3 d 后，使用共聚焦显微镜（Olympus FV1000,Japan）在GFP 激发光波长下检测荧光。结果表明MeMYC2.2蛋白在细胞核中表达（图2-A）。

为验证MeMYC2.2 蛋白是否具备转录自激活作用，本研究将MeMYC2.2-pGBKT7 转化酵母Y187感受态细胞，在SD/ -Trp + X-α-gal 培养基上对MeMYC2.2 蛋白的转录激活功能进行分析。结果（图2-B）表明，MeMYC2.2 基因的表达产物能够激活酵母α-半乳糖苷酶（MeL1）基因的表达，使得酵母细胞在SD/ -Trp + X-α-gal 平板上形成蓝色菌斑，说明MeMYC2.2 具备转录自激活功能，结合MeMYC2.2 蛋白定位于细胞核的结果，由此推断MeMYC2.2 可能是一个转录因子。

图2 MeMYC2.2 转录因子验证Fig.2 Validation experiments of transcription factor MeMYC2.2

2.4 MeMYC2.2过量表达能够提高拟南芥植株抗冻能力

采用农杆菌介导的浸花转化方法，获得MeMYC2.2 过量表达转基因拟南芥。经潮霉素抗性筛选获得的16 个T1代阳性转基因拟南芥，PCR 检测为阳性。T2代转基因拟南芥进一步在潮霉素抗性平板上通过3∶1 的筛选比，获得单拷贝转基因株系；T3代转基因拟南芥继续抗性筛选，最终得到单拷贝的转基因拟南芥纯合子。选取3 个T3代转基因纯合株系，采用RT-qPCR 方法检测过量表达株系中MeMYC2.2 基因的转录水平。结果（图3）显示，3个被检株系中MeMYC2.2 基因皆被高水平转录。

图3 转基因拟南芥中MeMYC2.2 表达分析Fig.3 Expression analysis of MeMYC2.2 in transgenic Arabidopsis plants

为验证MeMYC2.2 基因的过量表达对拟南芥植株抗冻性的影响，我们采用-20℃模拟冻害。结果（图4）显示，未经冻害处理时，MeMYC2.2 过量表达转基因拟南芥植株和野生型在形态特征上未有明显差异。冷冻处理4 h 的野生型拟南芥叶片逐渐开始出现萎蔫；而冷冻处理6 h 的野生型拟南芥叶片大面积出现枯萎，冻害严重，植株死亡率较高。而冷冻处理4 h 的MeMYC2.2 过量表达转基因拟南芥叶片可以正常伸展；如表3所示，与野生型对比，冻害延续至6 h 的转基因拟南芥冻害程度较轻，死亡率显著降低。经冷冻处理后，在22℃条件下恢复生长1周后，MeMYC2.2 过量表达转基因拟南芥的成活率显著高于野生型拟南芥。

表3 野生型和转基因植株冷冻处理后的存活率统计Table 3 Survival rates of wild-type and transgenic plants with cold treatment (n>30)

图4 转基因和野生型植株表现出不同的耐冻能力Fig.4 Wild-type and transgenic plants demonstrating different freezing tolerance abilities

由此可见，MeMYC2.2 基因的过表达对转基因拟南芥抗冻能力的提高有正调控作用。

2.5 CBF基因在转基因拟南芥中的表达分析

对冷冻胁迫（-20℃）下MeMYC2.2 过表达拟南芥及野生型拟南芥叶片中CBF基因的表达量进行RT-qPCR 分析。结果（图5）显示，与野生型拟南芥相比，CBF3基因的表达在MeMYC2.2 过表达拟南芥中受低温诱导更为明显。但其他3 个CBF基因在转基因拟南芥中受低温诱导的表达量明显低于其在野生型拟南中的表达量。

图5 冷冻胁迫下转基因拟南芥中CBF 基因的表达分析Fig.5 Expression analysis of CBF genes in transgenic Arabidopsis under cold stress

3 讨论

作为一种热带块根作物，木薯原产于温暖的热带地区，被归类于对寒冷敏感的物种［20］。低温对木薯储藏根及种茎损害极大，2008年1月份我国南方发生的冷冻灾害，导致广西、广东等省木薯产业造成巨大的破坏［21］。在10℃以下低温，木薯表现出明显的损害症状，包括产量下降、叶片扩展减少、褪绿甚至死亡［22］。本研究采用10℃做木薯低温胁迫处理与生产实际密切相关，并且对筛选基因做抗寒机理研究非常重要。

MYC2 转录因子是bHLH 转录因子家族成员之一，广泛存在于动植物中。MYC2 在植物应答逆境刺激时起重要调控作用，是JA 信号传导途径的核心调控因子，同时也是JA 与其他植物激素信号交互的关键节点［13］。已有研究表明，拟南芥MYC2 转录因子通过特异性结合CBF3启动子上的MYC 结合位点（CANNTG），正调控CBF3基因的表达［23］。大量研究证明CBF基因在植物抗寒方面是一个保守的信号途径，被认为是调控非生物胁迫转录因子中的核心调控因子［8］。CBF 转录因子属于AP2/ERF多基因家族，是植物抗冻性的关键调节因子［24-25］。CBF 转录因子能直接激活一系列提高冷冻耐受性的COR（冷调节）基因［26-28］，对于植物的冷驯化和抗冻性至关重要。已有研究显示，干扰CBF3 基因后，二穗短柄草在低温下的存活率显著降低［29］；而增强CBF3的表达，植株表现出更好的抗冻性［30-31］。

栽培木薯对低温敏感，但其低温敏感的分子基础尚不明确。CBF参与了多个低温响应基因（COR）表达的调控，直接影响植物的抗寒性。基因表达分析发现CBF基因在木薯顶芽中的表达缺失，这可能是造成木薯低温敏感的原因之一［20］。在拟南芥中，CBF基因表达在低温处理15 min 内显著上调，在2 h 后达到最高［32］。而木薯CBF基因表达对低温胁迫的响应明显滞后，需要数个小时后才开始响应，且其表达要在8 h 以上才达到最高［33］。过表达木薯CBF1基因的转基因植株对低温的耐受性明显提高［33］；研究也发现过表达木薯CBF4基因也可以提高转基因植物的抗寒性［34］。这说明木薯CBF基因同样具有调控抗寒性的功能，但木薯中CBF表达调控途径无法迅速响应低温胁迫信号。

为研究MeMYC2.2 转基因拟南芥抗冻性显著增强的原因是否与CBF 信号途径关联，对冷冻胁迫（-20℃）下MeMYC2.2 过表达拟南芥及野生型拟南芥叶片中CBF基因的表达量进行RT-qPCR 分析。结果显示，MeMYC2.2 过表达拟南芥植株中，仅CBF3的表达量较野生型植株显著提高，且随着冷冻胁迫时间的持续，MeMYC2.2 过表达拟南芥中CBF3 的表达丰度持续升高。这说明木薯MeMYC2.2 具有调控CBF 途径影响低温耐受性的可能性。栽培木薯中MeMYC2.2 的表达虽然对低温有响应，但其差异表达量变化倍数并不高，这一点是否与低温胁迫下木薯CBF基因表达模式有关还需要进一步研究。