黄芩提取物对肺结核大鼠免疫功能的调控作用

孔金玲 黄银秋 王笑 张慧群

(1长沙市第一医院感染科，湖南 长沙 410005；2重庆市公共卫生医疗救治中心)

肺结核是肺部受到结核分枝杆菌感染造成的具有传染性的呼吸系统疾病，病灶主要常见于支气管、气管、肺组织、胸膜部位〔1〕。结核分枝杆菌属于胞内寄生菌中的一类，主要存在于巨噬细胞内，表现于肺泡中，会导致肺部出现病变，若未及时治愈，可能会导致肺部癌变，造成不可挽回的后果〔2〕。一旦人体免疫力大幅度降低时，病菌则会向机体各器官侵袭，入侵肺部时，就会引起肺部结核感染，会表现出咳嗽、发热等症状〔3〕。据不完全资料统计，如今肺结核的死亡率仅次于免疫缺陷病毒性疾病，具有起病急、治疗困难、延迟时间长、复发率高的特点〔4，5〕。本文探究黄芩提取物对肺结核模型大鼠免疫功能的调控作用。

1 材料与方法

1.1动物与试剂 45只SPF级SD大鼠，雌雄各半，购自河南环宇康禾生物科技有限公司，动物许可证：SCXK(豫)2020-0004。6～9月龄，平均(7.13±1.42)月龄，体重245～310 g，平均(263.63±30.87)g，光照12 h/d，在湿度27%～36%、温度(29.93±4.27)℃的环境中喂养1 w。主要试剂：黄芩提取物(南京道斯夫生物科技有限公司，货号：dasf1545)，CD4+/CD8+、CD4+、CD8+(上海然哲仪器设备有限公司，货号：NovoCyt)，糖类抗原(CA)125、白细胞介素(IL)-10、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自上海梵态生物科技有限公司，干扰素(IFN)-γ ELISA试剂盒购自上海彩佑实业有限公司，转化生长因子(TGF)-β ELISA试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司，IL-6及TNF-α ELISA试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，转录因子(TCF)抗体(武汉菲恩生物科技有限公司，货号:FNAB08552)，糖原合成酶激酶(GSK)-3β抗体(武汉益普生物科技有限公司，货号：ATA30403)，β-catenin抗体(深圳欣博盛生物科技有限公司，货号：ATA40133)。

1.2方法

1.2.1分组及建模 将45只SPF级SD大鼠分为正常组、模型组、低剂量组、中低剂量组、高剂量组各9只，其中正常组不进行处理，剩余4组参照王青乐等〔6〕研究构建肺结核模型：使用标准人型结核菌株H37Rv在ABSL-3级实验室使用滴鼻法进行感染处理，菌液浓度为1×107CFU/ml，各组大鼠均滴鼻20 μl,建立肺结核大鼠模型。

1.2.2给药 建模成功后正常组、模型组均给予3 ml生理盐水，低剂量组给予1.5 g/kg黄芩提取物，中剂量组给予3.0 g/kg黄芩提取物，高剂量组给予6.0 g/kg黄芩提取物，1次/d，均连续灌胃2 w后观察大鼠变化。

1.2.3病理组织学观察 将大鼠全麻后行断头法处死，在低温、无菌条件下取大鼠肺组织，将肺组织用4%多聚甲醛中浸泡、固定，室温下用15%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙、脱水后用石蜡进行包埋，作3 μm切片，进行苏木素-伊红(HE)染色处理，使用光学显微镜观察大鼠脊髓病理变化。

1.2.4CD4+/CD8+、CD4+、CD8+水平检测 取大鼠尾静脉血2 ml，使用肝素钠行抗凝处理，使用流式细胞仪检测，将EDTA抗凝外周静脉血100 μl加入4个试管中,1个试管加入CD和CDg双标记单克隆抗体20 μl,另3个试管分别加入CD4+/CD8+、CD4+、CD8+单克隆抗体20 μl,充分混匀,孵育26℃ 15 min后,加入600 ml红细胞溶解液溶解10 min,以1 200 r/min，离心5 min除去上清,将细胞悬浮在500 μl的磷酸盐缓冲液(PBS)中进行流式细胞仪分析。

1.2.5胸腺指数 采用胸腺指数测定，将大鼠胸腺完全剥离，采用电子天平检测重量，计算胸腺指数，胸腺指数=胸腺质量/体重。

1.2.6CA125、IFN-γ、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-10水平检测 取右肺组织，用PBS冲洗3次，加入细胞裂解液在混匀机下冰浴破碎，于12 000 r/min离心机中4℃离心15 min，收集上清液于-80℃储存，沸水煮5 min，室内4℃保存。采用ELISA检测，取50 mmol/L碳酸盐包缓冲液稀释抗原加入聚苯乙烯反应孔，加盖处理。4℃环境内静置24 h，次日取出洗涤3次抛干，添加对照标本、0.1 ml待检标本，42℃条件下放置1 h，洗涤抛干，在每孔中加入低物液均匀，加入0.1 ml邻苯二胺遮光处理20 min，加入1 ml H2SO4，终止反应，经绘制标准曲线计算CA125、IFN-γ、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-10水平。

1.2.7Western印迹检测TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白 取所有大鼠肺组织蛋白，提取50μg蛋白，加入蛋白缓冲液内，提取常规蛋白并使用二喹啉甲酸(BCA)法对其进行定量分析。凝胶电泳、转膜，取膜，4 ℃下固定、封闭处理1 h，TCF、GSK-3β、β-catenin和内参β-actin蛋白在室内封闭90 min,按1∶1 000加入TCF抗体、GSK-3β抗体、β-catenin抗体、β-actin抗体，以1∶2 000加入c-fos抗体,4℃孵育过夜保存，之后使用0.05%～0.10% TBST洗膜，3次，5 min/次，二抗被0.05%～0.1% TBST稀释(1∶10 000)，摇动孵育时间为 1 h，TBST连续洗膜3次，5 min/次。二氨基联苯胺(DAB)显色，定量分析蛋白表达情况。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行F检验、独立样本t检验。

2 结 果

2.1病理组织学观察 正常组HE染色未发现病变。模型组实变内肉芽肿样病变形成，镜下见多核巨细胞多发淋巴细胞浸润，低剂量组伴大量泡沫细胞和巨噬细胞浸润；多核巨细胞、类上皮细胞上升，有结核小结形成，中剂量组在实变组织内见散在类上皮细胞形成，多核巨细胞较少，并有结核小结形成趋势，高剂量组可见肺泡间隔增宽，少量淋巴细胞浸润，中性粒细胞和巨噬细胞散在分布。见图1。

图1 各组肺组织病理观察(HE染色，×400)

2.2各组CD4+/CD8+、CD4+、CD8+、胸腺指数水平比较 模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指数水平明显低于正常组，CD8+水平明显高于正常组(P<0.05)；低剂量组、中剂量组、高剂量组CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指数水平明显高于模型组，CD8+水平明显低于模型组(P<0.05)；中剂量组、高剂量组CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指数水平明显高于低剂量组，CD8+水平明显低于低剂量组(P<0.05)；中剂量组CD4+/CD8+、CD4+、胸腺指数水平明显低于高剂量组，CD8+水平明显高于高剂量组(P<0.05)。见表1。

2.3各组CA125、IFN-γ、TGF-β水平比较 模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组CA125、IFN-γ、TGF-β水平明显高于正常组(P<0.05)；低剂量组、中剂量组、高剂量组CA125、IFN-γ、TGF-β水平明显低于模型组(P<0.05)；中剂量组、高剂量组CA125、IFN-γ、TGF-β水平明显低于低剂量组(P<0.05)；中剂量组CA125、IFN-γ、TGF-β水平明显高于高剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组CD4+/CD8+、CD4+、CD8+、胸腺指数、CA125、IFN-γ、TGF-β水平比较

2.4各组肺组织IL-6、TNF-α、IL-10水平比较 相比于正常组，模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组IL-6、TNF-α水平明显升高，IL-10水平明显降低(P<0.05)；与模型组相比，低剂量组、中剂量组、高剂量组IL-6、TNF-α水平明显降低，IL-10水平明显升高(P<0.05)；与低剂量组相比，中剂量组、高剂量组IL-6、TNF-α水平明显降低，IL-10水平明显升高(P<0.05)；与高剂量相比，中剂量组IL-6、TNF-α水平明显升高，IL-10水平明显降低(P<0.05)。见表2。

2.5各组Wnt/β-catenin信号通路蛋白基因表达比较 模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表达均明显高于正常组(均P<0.05)；低剂量组、中剂量组、高剂量组TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表达均明显降低于模型组(均P<0.05)；中剂量组、高剂量组TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表达均明显低于低剂量组(均P<0.05)；中剂量组TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表达均明显高于高剂量组(均P<0.05)。见表2、图2。

表2 各组肺组织IL-6、TNF-α、IL-10水平及Wnt/β-catenin信号通路蛋白基因表达量比较

1～5:正常组，模型组，低剂量组，中剂量组，高剂量组图2 Western印迹检测各组细胞Wnt/β-catenin信号通路蛋白

3 讨 论

结核病严重的会引起全身器官的病变，其中肺结核是结核病中发病率最高的一种，该病感染率、耐药率、死亡率均极高，一旦发病，将对患者的生命健康会造成及极严重的影响〔7,8〕。本研究提示，肺结核的发病与免疫体功能之间存在着一定的关系，机体免疫功能的降低会导致该病的发生及发展，同时，通过提升患者免疫功能也能较好地改善及抑制病情。

黄芩中提取的成分有汉黄芩苷、黄芩苷、黄芩新素、黄芩素、汉黄芩素等，其中黄芩苷的含量较高并作为药典中黄芩质量标准的检测指标。黄芩具有清热燥湿，泻火清心、凉血活血的功效，对人体有抗菌、抗病毒、清热燥湿的功效。抗病毒、抗菌：黄芩对革兰阴性菌、致病性皮肤真菌、革兰阳性菌有抑制作用。而且黄芩还能抑制乙型肝炎病毒、流感病毒等；清热燥湿：可用于湿温发热、湿热泻痢、湿热、胸闷、口渴不欲饮等病症〔9〕。现代药理学研究显示，黄芩有解热作用，在抗菌、抗感染、抗病毒等药理过程中均有体现。本文研究说明，高剂量岑提取物可有效改善肺结核模型大鼠免疫功能，抑制通路因子的异常表达，调节机体免疫反应，效果显著。

CD4+属于T细胞亚群，表达于T细胞受体中，一定程度上能够反映出机体的免疫功能，参与肺结核的发病〔10〕。同时CD4+还能够起到激活CD8+的作用，对于细菌的侵袭感染均具有较好的抵抗效果，提升患者的免疫功能，且一定程度上还能消灭肺结核致病菌〔11〕。CD8+T细胞在被CD4+激活后，会参与机体的免疫系统中，参与抗结核病的保护机制中，能够有效抑制细菌的增殖〔12,13〕。本研究说明高剂量芩提取物对肺结核模型大鼠CD4+/CD8+、CD4+、CD8+水平有一定的调控作用，效果显著。

CA125是一种高分子量糖蛋白,其在机体众多细菌性疾病及免疫性疾病中均呈现异常表达〔14，15〕。IFN-γ在机体众免疫系统中均存在一定的调节作用，能够增强细胞的免疫功能〔16,17〕。TGF-β是重要的致肺纤维化细胞因子，活化TGF-β因子在肺纤维化细胞间质胶原的合成和分解、增殖和分裂中发挥重要作用〔18〕。IL-6可诱导B细胞分化和抗体产生，在机体免疫应答中起到一定作用〔19〕。TNF-α是巨噬细胞产生的急性炎症细胞因子〔20〕。IL-10由B细胞、单核巨噬细胞等产生，属于抑制炎症反应的细胞因子，在慢性病程中可以抑制细胞介导的免疫应答〔21〕。本文结果说明高剂量岑提取物可有效抑制肺结核模型大鼠CA125、IFN-γ、TGF-β、IL-6、TNF-α、IL-10水平，可有效降低炎症反应，抑炎因子产生，效果显著。Wnt通过自分泌发挥作用，是分泌型糖蛋白。Wnt信号通路在多种细胞增殖再生、分化、迁移中起着重要的调节作用。研究显示，Wnt/β-catenin信号通路参与了肺癌和纤维化的发生发展，在肺泡巨噬细胞抗感染中发挥免疫调控作用，其长链非编码RNA是转录长度>200 nt的RNA分子，不能直接编码蛋白质，但能抑制染色质重塑、参与转录、转录后水平上调控基因表达〔22〕。本研究显示，高剂量黄芩提取物可有效抑制肺结核模型大鼠Wnt/β-catenin信信号通路蛋白基因表达量，从而控制其大鼠病情发展。

综上，黄芩提取物通过作用于Wnt/β-catenin信号通路，调控TCF、GSK-3β、β-catenin蛋白表达，可有效改善免疫功能的异常表达及炎症反应。