南京市乙肝病人乙型肝炎病毒P区突变特点与肝癌易感性的相关性分析

徐露露，张琴，时瑞，金晓燕，孙梅

乙肝是由乙型肝炎病毒（HBV）感染所致的常见肝病。相关研究显示，在全球范围内约有2.4亿人长期感染HBV，长期慢性HBV感染可导致肝纤维化、肝硬化，严重者可导致肝癌［1-2］。大量研究表明，HBV感染是乙肝病人高发肝癌的重要因素，加之长期药物治疗易使多聚酶区产生耐药性突变，导致HBV难以被清除，因此，HBV突变特点在乙肝病人病情程度的预测中发挥重要的临床意义［3］。而HBV-P区是HBV重要的多聚酶区，其突变特点与HBV耐药有关，但关于其与肝癌易感性的报道较少［3-4］。对此，本研究检测南京市第二医院乙肝病人HBV-P区突变情况，并分析其与肝癌易感性的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年1月至2020年12月南京市第二医院乙肝病人1 100例，纳入标准：经临床症状、病史、实验室、超声或CT等检查为乙肝［5］，年龄＞18岁、无精神病病史，无心、肺、肾等功能不全，临床资料完整，签署知情同意书；排除标准：合并乳腺癌、胃癌等其他肿瘤，孕产妇或哺乳期女性，检查前3个月有免疫、化疗、放疗等治疗史，合并心、肺、肾等功能不全及精神病病史，具有检查禁忌证。病人均签署知情同意书。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

分组标准：乙肝组：乙肝病毒感染后，但未发生癌变的病人（包括肝硬化）；肝癌组：乙肝病毒感染后，乙肝细胞发生癌变的病人。

1.2 方法所有病人均行常规肝功能、HBV基因分型及其P区突变、病理等检查，所有操作均严格依据相关说明书进行。主要试剂与仪器，AU5800全自动生化分析仪及测定谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总胆红素（TBiL）试剂购自美国贝克曼库尔特公司，HBV检测试剂购自湖南圣湘生物科技有限公司，HBV全基因组提取试剂盒、乙型肝炎病毒耐药基因突变检测试剂盒均购自中山大学达安基因股份有限公司，ABI3500基因测序仪及配套Data Collection与Sequencing Analysis测序软件购自美国Life technology公司，取空腹静脉血5 mL并分离血清（3 000 r/min，10 min）后保存于-20 ℃冰箱。肝功能检查，常规以AU5800全自动生化分析仪及试剂检测ALT、AST、TBiL；HBV检测，ABI Prism7500荧光定量PCR仪及湖南圣湘定量检测试剂盒行定量分析；HBV-P区突变检测，采用中山大学达安基因提取试剂盒提取HBV基因组，以中山大学达安基因股份有限公司乙型肝炎病毒耐药基因突变检测试剂盒采用聚合酶链反应（PCR）-测序法行HBV-P区核酸扩增，纯化处理后以ABI3500基因测序仪行测序和基因分型、耐药突变位点检测，采用Data Collection与Sequencing Analysis测序软件确定突变位点；病理检查，肝穿刺或手术后取肝病变组织，送病理学行常规病理检查肝癌发生情况。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0软件，计数资料采用χ2检验，计量资料以±s表示，符合正态分布的采用t检验，HBV-P区突变特点与肝癌易感性的相关性采用logistic回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乙肝组和肝癌组HBV-P区突变情况病理切片检查显示1 100例乙肝病毒感染者中，HBV-P区突变650例，占比59.09%；其中肝癌病人24例，占比2.18%。

2.2 肝癌组和乙肝组一般资料比较肝癌组和乙肝组一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 肝癌组和乙肝组一般资料比较

2.3 肝癌组和乙肝组HBV-P区突变率比较乙肝组的HBV-P区突变率为58.18%（626/1 076），肝癌组HBV-P区均发生突变，突变率为100.00%（24/24），显著高于乙肝组，差异有统计学意义（χ2=16.99，P＜0.001）；在乙肝组和肝癌组中，rt204突变比率均最高，并且肝癌组（41.67%）此位点突变率显著高于乙肝组（15.34%）。结果还显示rt180，rt250位点在肝癌组（25%，16.67%）中突变率也高于乙肝组（8.63%，5，11%），差异有统计学意义（P＜0.05），见表2，3。

表2 肝癌组和乙肝组HBV-P区位点突变率比较/例（%）

表3 肝癌组和乙肝组HBV-P区位点突变率比较/例（%）

2.4 HBV-P区突变特点与肝癌易感性的相关性分析logistic回归分析结果显示，将乙肝病人是否发生肝癌设为Y变量（是=1、否=0），将rt204、rt180、rt250位点是否突变设为X变量（是=1、否=0）时，rt204、rt180、rt250位点突变是乙肝病人发生肝癌易感性的独立影响因素（P＜0.05），见表4。

表4 HBV-P区突变特点与肝癌易感性的logistic回归分析

3 讨论

乙肝发病机制复杂，主要与HBV感染有关，与饮食、黄曲霉素摄入等因素也有相关性，可导致肝区疼痛、腹胀、肝脾肿大等症状。目前，对于乙肝病人的主要治疗策略均以干扰素与抗病毒药物治疗为主，经证实其疗效已逐渐被认可［6-7］。但在临床治疗中，尚无特效疗法，尤其是长期HBV感染可加剧肝细胞损坏，加之HBV为双链DNA病毒，易发生变异、耐药，导致病情迁延不愈，引起肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌［8-9］。而有研究显示，HBV可分为A-I共9型，呈地理区域性分布，其会诱导机体发生自身免疫反应、免疫耐受性损害等病理变化，导致HBV不易被免疫系统清除，从而增加治疗难度，提示分析乙肝病人HBV突变特点对评估其病情变化具有重要的临床意义［10-11］。

本研究结果中，结合病理组织学检查结果显示，所纳入的南京市1 100例乙肝病人中，肝癌发生率为2.18%，肝癌病人HBV-P区均发生突变，且突变率显著高于乙肝组，表明HBV-P区突变的乙肝病人者较易发生肝癌。据相关研究表明，HBV-P区突变与HBV耐药、不易被免疫清除等改变有关，酪氨酸（Y）-蛋氨酸（M）-门冬氨酸（D）-D变异是HBV最常见的耐药变异模式，主要由蛋氨酸（M）被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）取代所致，进而增加乙肝病毒核心抗原（HBcAg）的产量而加强HBV的复制能力，并可调节pg RNA转录水平或促使其衣壳化，使HBV耐药而不易被免疫清除［12-13］。因此，乙肝病人HBV-P区突变时可能促使Y-M-D-D变异，使机体发生自身免疫反应、免疫耐受性损害等病理变化，诱导HBV耐药并增强其复制能力，增强了HBV的存活能力而不易被机体免疫或药物治疗清除，使病人长期处于HBV感染中，从而导致肝癌［14-15］。同时，本研究还发现HBV-P区突变特点中，肝癌病人rt204、rt180、rt250位点突变率明显高于乙肝组，logistic回归分析结果显示rt204、rt180、rt250位点突变是乙肝病人发生肝癌易感性的独立影响因素，表明rt204、rt180、rt250位点突变可能易导致乙肝病人发生肝癌。有研究报道，HBV-P区含多个位点，不同位点突变的作用存在差异，其中rt204、rt180、rt250等位点突变可能导致HBV原结构和功能改变［16］。因此，本研究认为HBV-P区中rt204、rt180、rt250等位点突变可能会促使Y-M-D-D变异，使M变为V或I，引起了pg RNA转录改变或衣壳化，并促使HBcAg产量增加而加强了HBV复制能力，增强了HBV耐药及存活能力而不易被清除，使乙肝病人长期处于HBV感染中，加剧了肝细胞损坏而促使了病情进展，从而引起肝纤维化、肝硬化，最终导致肝癌。故本研究认为，应重视乙肝病人HBV检测，尤其是重点分析HBV-P区突变特点，对rt204、rt180、rt250等位点突变者应警惕其肝癌易感性，加强对该人群的病情监测和治疗。

本研究也有局限性，如乙肝病人呈地理区域性分布，且乙肝病人HBV-P区突变特点复杂，不同位点突变的作用存在差异，尚不足以代表所有病患情况，今后还需更深入、更大样本研究。但本研究确切发现，南京市乙肝病人HBV-P区突变特点与肝癌易感性有关，其中rt204、rt180、rt250位点突变可能易导致肝癌发生，临床治疗时应重视病情监测。