基于网络药理学及分子对接探究胎元饮治疗先兆流产的作用机制※

黎佩茹 林朗华 何思雅 潘美均 吴爱华,2 梁雪芳,3△

(1.广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510006；2.广东省中医院生殖医学科，广东 广州 510000；3.广东省中医院妇科，广东 广州 510000)

先兆流产是最常见的妊娠并发症，发病率为15%～20%，并且发生率呈逐年上升趋势[1-2]，对妇女的身体、心理健康造成严重影响。先兆流产若未得到及时治疗，约10%～15%的患者可发展为难免流产[3]。先兆流产的病因复杂，涉及因素繁多，且其相关发病机制尚未完全阐明，西医治疗一般采用适当休息、禁止性生活，同时予人绒毛膜促性腺激素、孕激素等药物治疗[4]。先兆流产属中医学“胎漏”“胎动不安”范畴。中医药治疗先兆流产临床疗效显著，不良反应少[1]。中医学认为，气虚胎失所载，血虚胎失所养，气血虚弱，冲任失养，胎气不固，故见胎漏或胎动不安[5]，气血虚弱是先兆流产的重要病机。胎元饮出自张景岳所著《景岳全书》，具有补气养血、固肾安胎之功，主治气血虚弱型胎漏、胎动不安，是中医临床治疗先兆流产的经典方剂[5-6]。

网络药理学对“药物-成分-靶点-疾病”的相互作用关系进行分析，并对药物的作用机制进行预测，为将中医从经验医学转化为循证医学体系提供了新的研究方法，是近年来中医药研究的新方法[7-8]。因此，本研究基于网络药理学和分子对接技术对胎元饮治疗先兆流产的主要活性成分及核心靶点等进行预测、分析，探讨胎元饮治疗先兆流产的作用机制，以为临床推广提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 胎元饮有效成分及相关作用靶点筛选 在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，https://tcmsp-e.com/)[9]，分别以胎元饮中的8味中药“白芍”“白术”“陈皮”“当归”“杜仲”“甘草”“人参”“熟地黄”为关键词进行检索，然后根据药物药动学特征[口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18]，筛选出胎元饮的有效活性成分及其作用的蛋白质靶点，并根据目前已发表的文献报道来补充未预测到的有效活性成分的已知靶点。然后利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org)选取已被验证的人类蛋白，将靶点进行标准化处理，以获取基因名。

1.2 先兆流产相关靶点筛选 以“threatened abortion” “threatened miscarriage”为关键词，在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、DrugBank数据库(https://www.drugbank.com/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、PharmGKB数据库(https://www.pharmgkb.org/)、TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd)中检索先兆流产的相关靶点，最后合并5个数据库靶点，并删除重复值，获得先兆流产疾病相关靶点。

1.3 “药物-疾病”交集靶点获取 利用R语言(R i386 4.0.5)将胎元饮有效活性成分靶点与先兆流产疾病相关靶点取交集并绘制韦恩图。

1.4 “药物-成分-靶点-疾病”网络构建及分析 将以上步骤得到的药物有效活性成分、有效活性成分对应的靶点、“药物-疾病”交集靶点的数据整合，运用 Cytoscape 3.7.2软件构建 “药物-成分-靶点-疾病”网络图，并利用Cytoscape 3.7.2 软件中“Network Analyzer”的功能，计算出不同节点的度(Degree)值，Degree值越大，节点面积越大，表示该节点的生物功能越重要。根据 Degree 值由大到小排序，筛选前3位作为胎元饮的主要活性成分。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建及分析 将“药物-疾病”交集靶点提交至STRING 11.0数据库(https://string-db.org)构建PPI网络模型[10]，将生物种类设定为“Homo sapiens”，参数设置均为默认设置。将获得的PPI网络导入Cytoscape 3.7.2软件绘制PPI网络图，并使用Cytoscape 3.7.2软件中CytoNCA插件的初始网络节点的中介中心性(betweenness centrality, BC)、紧密中心性(closeness centrality, CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality, EC)、度中心性(degree centrality，DC)、局部平均连通性(local average connectivity-based method, LAC)、网络中心性(network centrality, NC)等拓扑学参数的中位数作为筛选依据进行1次筛选以精简网络。最后再利用Cytoscape 3.7.2软件中的MCODE 1.6.1插件，根据该插件默认参数 “degree cutoff ≥2, node score cutoff≥0.2,K-score≥2, maximum depth=100”得到不同的靶点团[11]，选取分数(score)最高的靶点团作为胎元饮治疗先兆流产的核心靶点团。其中，MCODE score 可反映单个节点与其周围节点的紧密程度[12]，将靶点团中MCODE score 排名前3的靶点作为胎元饮治疗先兆流产的核心靶点。

1.6 “药物-疾病”交集靶点基因本体(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析 运用R语言(R i386 4.0.5)将“药物-疾病”交集靶点的基因名转换为Entrez ID，并将ClusterProfiler、DOSE、enrichplot等软件包安装至R软件中，通过运行ClusterProfiler进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，按P值由小到大排序，分别筛选出排名前10的条目绘制GO功能富集分析气泡图，排名前30的通路制作KEGG通路富集分析条形图。其中，GO功能包括生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)及分子功能(molecular function, MF)。

1.7 分子对接验证 将筛选得到的胎元饮主要活性成分与PPI网络分析得到的核心靶点进行分子对接验证。首先从PDB数据库(https://www.rcsb.org/)下载PPI网络中核心靶点PDB格式的3D结构，通过PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取主要活性成分的sdf结构，并通过OpenBabel转换成PDB文件；再运用AutoDock Tools 1.5.6软件对蛋白质靶点进行去水、加氢等操作，并将活性成分及靶蛋白格式转换为pdbqt格式；最后通过 AutoDock Vina 进行分子对接，选取部分结合力较强结果利用Pymol软件进行可视化。

2 结果

2.1 胎元饮有效成分及其相关作用靶点 在TCMSP数据库中共得到符合筛选标准的有效成分191个，其中白芍14个，白术7个，陈皮77个，当归5个，杜仲41个，甘草103个，人参25个，熟地黄11个(有的成分同时存在于不同的药物中)。将8味中药有效成分的作用靶点合并、删除重复值后共得到靶点307个。

2.2 先兆流产相关靶点 在GeneCards、DrugBank数据库中分别检索出1849、3个先兆流产相关靶点，OMIM、PharmGKB、TTD数据库中未检索到相关靶点。把上述数据库的相关靶点汇总、去重后共得到1849个疾病靶点。

2.3 “药物-疾病”交集靶点 将筛选的307个胎元饮有效成分作用靶点与先兆流产疾病靶点取交集，再通过R 语言绘制韦恩图，得到“药物-疾病”交集靶点162个，见图 1。

图1 “药物-疾病”交集靶点韦恩图

2.4 “药物-成分-靶点-疾病”网络构建及分析 运用 Cytoscape 3.7.2软件构建胎元饮与先兆流产之间的“药物-成分-靶点-疾病”网络图，见图2。根据Cytoscape 3.7.2中“Network Analyzer”计算的Degree值，排名前3位的分别为山柰酚(kaempferol)、木黄酮(genistein)、熊果酸(ursolic acid)，为主要活性成分。见表1。

表1 胎元饮的主要活性成分

图2 “药物-成分-靶点-疾病”网络图

2.5 PPI网络构建及分析 将“药物-疾病”交集靶点提交至STRING 11.0数据库，得到PPI网络，再将得到的网络数据导入Cytoscape 3.7.2软件进行网络构建，获得初始PPI网络图(见图3A)。初始PPI网络由162个节点和2875条边组成。经CytoNCA插件进行拓扑学分析，得到由58个节点和1208条边组成的精简PPI网络(见图3B)。最终经 MCODE 1.6.1插件分析得到由48个节点和933条边组成的核心靶点团(MCODE score为39.702)，在该靶点团中，MCODE score 排名前3的靶点分别为CC基序趋化因子2(C-C motif chemokine 2，CCL2)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、丝裂原活化蛋白激酶 8(mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8)(见图3C)，其 MCODE score 分别为 28.29、28.24 和27.99。

图3 PPI网络图

2.6 “药物-疾病”交集靶点GO功能和KEGG通路富集分析 运用R语言对162个交集靶点进行 GO 功能富集分析，共获得2854个条目，其中BP 2524个，MF 131个，CC 199个。根据P值排序，筛选出排名前10的条目绘制气泡图(见图4)。根据气泡图结果，可以推测出胎元饮治疗先兆流产的BP主要涉及对脂多糖反应(response to lipopolysaccharide)、对类固醇激素的反应(response to steroid hormone)、肌肉细胞增殖(muscle cell proliferation)等；CC主要与膜筏(membrane raft)、膜微结构域(membrane microdomain)、膜区(membrane region)等相关；MF主要涉及血红素结合(heme binding)、四吡咯绑定(tetrapyrrole binding)、丝氨酸水解酶活性(serine hydrolase activity)。

注：纵坐标为富集条目，横坐标为该 GO 的基因数占输入总基因的比率，气泡越大代表该 GO 的基因越多；颜色代表P值的大小，P值越小，颜色越红，则表示富集程度越高

KEGG 通路富集分析可获得183条代谢通路，按P值由小到大排序筛选出排名前30的通路绘制条形图(见图5)，剔除不相关通路，预测胎元饮可能通过白细胞介素17(IL-17)信号通路(IL-17 signaling pathway)、p53通路(p53 signaling pathway)、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路(PI3K/Akt signaling pathway)等治疗先兆流产。通过查阅文献，PI3K/Akt信号通路可能是胎元饮治疗先兆流产的主要作用途径，信号通路见图6。

注：纵坐标为通路名称，横坐标为富集基因数；P值代表富集的显著性，P值越小，颜色越红，则富集程度越高

图6 PI3K/Akt信号通路图

2.7 分子对接结果 参考文献[13-14]数据，结合能≤-5.0 kcal/mol认为可结合，≤-7.0 kcal/mol认为结合能力较强，即配体与受体具有较好的结合活性。若结合能>-5.0 kcal/mol认为结合能力较弱。本研究分子对接结果显示，3个主要主要活性与3个核心靶点的结合能力整体较强，其中熊果酸与EGFR结合能为-9.4 kcal/mol，结合活性最高(见表2)。选择各靶点对应成分结合能低且能形成氢键的对接组合进行绘图。结果显示，化学物配体均结合在靶蛋白的活性口袋内且匹配良好。各核心靶点-主要活性成分分子对接模拟图及对接位点见图7。

表2 分子对接结果 kcal/mol

注：A为山柰酚-CCL2对接图，B为木黄酮-CCL2对接图，C为熊果酸-CCL2对接图；D为山柰酚-EGFR对接图，E为木黄酮-EGFR对接图，F为熊果酸-EGFR对接图；G为山柰酚-MAPK8对接图，H为木黄酮-MAPK8对接图，I为熊果酸-MAPK8对接图

3 讨论

多项临床研究已表明，胎元饮治疗先兆流产有较好的疗效。有研究显示，胎元饮治疗气血虚弱型先兆流产2周后的有效率可达98%，并且发现胎元饮可能通过调节气血虚弱型先兆流产患者外周血IL-2、干扰素γ(IFN-γ)、IL-10及转化生长因子β1(TGF-β1)的表达发挥治疗作用[15]。赵伟等[16]研究显示，加味胎元饮配合黄体酮治疗早期先兆流产的疗效及血清β-人绒毛膜促性腺激素(β-HCG)水平均优于单用黄体酮治疗(P<0.05)，由此可知加味胎元饮配合黄体酮治疗先兆流产的效果优于单独应用黄体酮。

本研究结果显示，初始PPI网络有162种靶点，存在2875种作用关系，充分体现了中药多靶点的作用特点。MCODE 1.6.1插件分析得到3个核心靶点，分别为CCL2、EGFR、MAPK8。免疫学认为，妊娠属于一种特殊的同种异体移植，妊娠结局的关键在于母体与胚胎之间的免疫平衡。趋化因子参与反复自然流产的发生发展，其高表达会使妊娠维持，减少流产，在维持胎儿正常发育中有重要作用。CCL2是典型的炎性趋化因子，与免疫系统密切联系，参与血管生成、炎性反应过程，其异常表达可使胚胎植入、形成障碍从而诱发流产[17-18]。一项关于CCL2与早期流产相关性的临床研究亦证明了早孕母胎界面绒毛和蜕膜组织中可见CCL2的表达，CCL2高表达与早期流产的发病机制有关[19]。胎盘是维持胎儿生长发育的重要器官，具有物质交换、防御、合成及免疫等功能。胎盘由羊膜、叶状绒毛膜和底蜕膜构成，其中叶状绒毛膜是胎盘的主要结构。生理状态下，晚期囊胚着床之后，着床部位的滋养层细胞迅速分裂增殖。有研究报道，EGF及其受体在早期妊娠组织中表达下降，推测EGFR及其配体促进细胞增殖和分化的作用降低，从而使滋养细胞增殖、分化受到抑制，因此EGF调控HCG的生成及HCG维持黄体的作用受到抑制[20]。植枝福等[21]研究也证明了绒毛组织中EGFR的表达与绒毛血管生成状况密切相关，EGFR低表达可导致绒毛血管形成障碍。辅助性T淋巴细胞(Th)在调节免疫反应中承担着核心角色作用[22]。妊娠期间Th1细胞因子高表达，Th2细胞因子低表达，Th1/Th2细胞因子平衡偏向Th1可能与流产的发生相关[23]。MAPK8是Th细胞极化分化为Th1细胞必需的因子[24]，由此推测MAPK8与先兆流产存在着一定的联系。分子对接验证结果亦表明，山柰酚、木黄酮、熊果酸与核心靶点(CCL2、EGFR、MAPK8)的结合活性较强，因此胎元饮可能主要通过山柰酚、木黄酮、熊果酸等治疗先兆流产。

GO功能富集分析显示胎元饮治疗先兆流产主要与脂多糖反应、对类固醇激素的反应、血红素结合、丝氨酸水解酶活性等方面有关。KEGG通路富集分析显示，寿胎丸治疗先兆流产可能的信号通路为IL-17、p53、PI3K/Akt信号通路。细胞因子对于维持和协调人类孕期免疫细胞的正常活动至关重要。IL-17是一种促炎细胞因子，主要由Th17细胞产生。关于人类母胎界面，有学者认为蜕膜细胞通过分泌CCL2来吸引Th17细胞，并通过分泌IL-17抑制人类滋养层细胞的凋亡，并诱导它们增殖并侵入蜕膜[25]。有研究发现，血IL-17水平在健康妊娠中升高，但在自然流产中未表现升高，根据这一发现推测IL-17为维持妊娠必不可少的调节细胞因子[26]。有研究在人类自然流产绒毛中发现，在促凋亡合胞体滋养层中观察到细胞质和顶膜上的层黏连蛋白受体表达增加，而这一过程最有可能是由p53介导的[27-28]。研究表明，p53信号通路功能异常及p53通路基因多态性的改变均可影响蜕膜化及妊娠结局[27]。相关文献报道显示，PI3K/Akt信号通路在细胞增殖和胚胎发育中扮演着重要角色[29]。若PI3K/Akt信号通路一旦受到抑制，可激活线粒体凋亡途径，进而引起滋养细胞凋亡增加，最终导致分泌β-HCG和孕酮的功能降低，继而可导致胎儿生长发育停止[30]。

综上所述，本研究表明胎元饮治疗先兆流产主要的活性成分可能为山柰酚、木黄酮、熊果酸等，这些活性成分通过作用于CCL2、EGFR、MAPK8等靶标以及调节IL-17、p53、PI3K/Akt等信号通路发挥治疗作用，从而实现调节母体免疫状态、促进滋养层细胞增殖等生物过程来维持妊娠，体现了胎元饮多通路、多靶点联合作用的特点，为胎元饮治疗先兆流产的临床运用提供了科学依据，为后续挖掘其潜在作用机制提供了新角度。