南极磷虾粉替代鱼粉对雌性黄鳝生长及生殖性能的影响

2023-01-30岳华梅李创举

水生生物学报 2023年2期

符鹏岳华梅阮瑞叶欢李忠李创举

(中国水产科学研究院长江水产研究所, 农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室, 武汉 430223)

黄鳝(Monopterus albus), 俗称鳝鱼, 隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、合鳃目(Synbranchiformes)、黄鳝属(Monopterus), 是一种典型具有性转换的鱼类(先雌后雄), 同时也是我国一种重要的淡水特种经济鱼类之一[1]。黄鳝全人工繁殖技术虽已突破[2],但目前仍然存在一些瓶颈, 如人工繁殖亲鱼主要依赖于捕捞的野生资源; 人工养殖的黄鳝亲鱼量不能满足当前的规模化人工繁殖需求; 人工配合饲料饲喂的雌性黄鳝卵巢成熟度差, 导致亲鳝繁殖性能不佳, 受精率低等问题。当前市售黄鳝的全人工配合饲料尚不能满足黄鳝亲鱼生长及性腺发育的需要,因此如何改善配合饲料配方, 提升养殖亲鳝生长繁殖性能是当前研究的热点。

南极磷虾粉(Antarctic krill meal)是替代鱼粉理想的优质蛋白源之一, 其氨基酸种类齐全, 脂肪量与一级红鱼粉含量相当, 同时还含有天然的抗氧化剂——虾青素[3,4]和条件性必需氨基酸——牛磺酸[5]。研究表明南极磷虾粉能够提高鱼类的生长性能、肌肉品质、免疫代谢能力及繁殖性能。例如, 在饲料中添加一定比例的南极磷虾粉能够显著提高银鲳(Pampus argenteus)[6]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[7]、黄鳝(Monopterus albus)[8]和鳕(Gadus cha-lcogrammus)[9]等鱼类的生长性能。南极磷虾粉添加能够改善黄颡鱼[7]、大黄鱼(Larimichthys crocea)[10]和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[11]等鱼类的肌肉品质, 并显著提高黄鳝[8]、圆斑星鲽(Verasper variegatus)[12]和欧洲鲈(Dicentrarchus labrax)[13]等鱼类的免疫代谢能力。在繁殖性能方面, 饲喂含南极磷虾粉的配合饲料能够显著提高凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的性腺指数[14], 以及半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的相对产卵量[15]。基于此, 本研究以二冬龄雌性黄鳝为研究对象, 检测人工配合饲料中不同比例南极磷虾粉替代鱼粉对其生长性能、抗氧化能力、非特异性免疫及生殖性能的影响, 以期为养殖雌性黄鳝的饲料配方优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验饲料

饲料以鱼粉(秘鲁)和南极磷虾粉(青岛市远洋捕捞有限公司)、脱脂豆粕(甘肃华羚乳品集团公司)、鸡肉粉(美国温泽世家有限公司)作为蛋白源,鱼油(福州开发区高龙实业有限公司)作为脂肪源,小麦面粉(唐河县恒昌面粉有限公司)作为糖源。实验通过设置0(Diet 1)、20%(Diet 2)、40%(Diet 3)、60%(Diet 4)、80%(Diet 5)和100%(Diet 6)的磷虾粉替代鱼粉配制6组等氮等能饲料(表1)。饲料原料经粉碎后过60目筛, 按表1配比精确称量, 然后充分混匀, 原料用量较低者采取逐渐混合法添加。采用32型制粒机(浙江民益食品机械有限公司)将饲料预混料加工成直径约为2.00 mm的长条状饲料, 烘干破碎后将饲料密封放置于–20℃冰柜中备用。饲料在投喂前加入20%自来水, 团成团状后进行饲喂。

表1 实验饲料的组成与营养成分(干重, g/kg)Tab.1 Composition and nutritional composition of experimental diets (dry weight basis, g/kg)

1.2 养殖管理

实验鱼购自湖北省仙桃市张沟镇忠善黄鳝养殖合作社, 养殖场地为该合作社池塘网箱。池塘网箱规格为2.00 m×1.00 m×1.50 m(长×宽×高), 养殖水深为1.67 m。实验共计6个处理组, 每处理组设3个平行, 每个平行组选用健康无损伤的初始体质量为(36.41±3.62) g二冬龄雌性黄鳝50尾, 养殖周期为12周。养殖采用表观饱食投喂法, 除极端恶劣天气不进行投喂外每天下午5:30—6:30投喂1次。每6天停止投喂1次, 投喂后1h内及时捞出残饵, 后烘干称重。实验养殖用水为池塘水加地下水, 养殖周期内,溶解氧5.98—7.72 mg/L, pH范围7.50—7.70, 氨氮平均值为2.03 mgN/L, 水体硬度92德国度, 养殖水温为22.60—28.90℃。

1.3 样品采集与测定

在养殖试验结束后, 所有鱼经24h饥饿处理, 随后进行逐箱称重及尾数统计, 以统计分析生长相关指标, 包括增重率(Weight gain rate, WGR)以及特定生长率(Specific growth rate, SGR)。每个网箱随机选取9尾鱼, 采用100 mg/L MS-222(Sigma, St.Louis,MO, USA)麻醉处理后, 称取个体体重及体长, 以计算肥满度(Condition factor, CF)。解剖分离全部内脏组织并称重, 用于脏体比(Viscerosomatic index, VSI)的测定; 取肝脏组织, 保存于–80℃冰箱, 用于肝体比(Hepatosomatic index, HSI)、抗氧化指标及非特异性免疫指标的测定。解剖取卵巢组织称重, 用于性腺指数(Gonadosomatic index, GSI)指标的测定;随后同时取背部肌肉和卵巢样品冻存, 用于后续相关营养成分指标的测定。

实验饲料、肌肉和卵巢的营养成分测定采用标准方法进行, 粗蛋白质测定采用微量凯氏定氮法,粗脂肪测定采用索氏抽提法, 粗灰分测定采用550℃灼烧法, 水分测定采用105℃烘干法。肝脏抗氧化指标包括过氧化氢酶(Catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)和丙二醛(Malondialdehyde, MDA), 以及非特异性免疫指标包括碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AKP)、补体C4(Complement 4, C4)和免疫球蛋白M (Immunoglobulin M, IgM), 均采用南京建成生物工程研究所生产的相关试剂盒测定, 相应操作参照说明书进行。

为进行雌鳝个体生殖力指标测定, 在各个养殖网箱再随机抽取9条鱼, 麻醉后称重, 随后尾柄处静脉采血1.50 mL, 4℃静置过夜, 然后3000 r/min离心10min, 小心分离上层血清, 置于–80℃保存备用。血清雌二醇含量测定采用美国Cayman CHEMICAL公司的Estradiol ELISA Kit试剂盒(Item No.501890)进行。解剖分离性腺称重后保存于PBS溶液中, 统计具有卵黄颗粒积累的卵细胞数目, 以便后期计算绝对怀卵量、相对怀卵量等指标; 卵细胞直径采用体式显微镜(Olympus)目镜测微尺测定。

1.4 计算公式

增重率(WGR, %)=100×(终末体重–初始体重)/初始体重

特定生长率(SGR, %)=100×[(ln终末体重–ln初始体重)/投喂天数]

饲料系数(FCR)=摄食量/(终末体重–初始体重)

肥满度(CF, g/cm3)=100×鱼体体重/(体长)3

肝体比(HSI)=100×肝胰重/终末体重

脏体比(VSI)=100×内脏重/终末体重

性腺指数(GSI)=100×性腺重/终末体重

绝对怀卵量(F, 粒)=一条鱼的卵粒总数量

相对怀卵量(RF, 粒/g)=绝对怀卵量/终末体重

1.5 数据统计分析

实验数据用平均值±标准误(mean±SE) 表示,采用SPSS 22.0进行单因素方差分析, Duncan法进行多重比较,P＜0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 南极磷虾粉替代鱼粉对雌鳝生长性能及形体指标的影响

黄鳝的增重率(WGR)和特定生长率(SGR)在对照组(Diet 1)、20%磷虾粉替代组(Diet 2)、40%替代组(Diet 3)之间无显著性差异(P>0.05; 表2)。随着替代水平的进一步提高, 其增重率和特定生长率呈下降趋势(P<0.05)。20%替代组饲料系数(FCR)与对照组无显著性差异(P>0.05), 随着替代水平的提高, 饲料系数随之升高(P<0.05)。

形体指标统计结果显示, 对照组黄鳝脏体比(VSI)显著高于80%替代组(Diet 5)和100%替代组(Diet 6;P<0.05), 而与其他组无显著性差异(P>0.05)。20%替代组肝体比(HSI)与对照组无显著性差异(P>0.05), 但显著高于其他四个高水平替代组(P<0.05)。黄鳝肥满度(CF)各组间无显著性差异(P>0.05; 表2)。

表2 南极磷虾粉替代鱼粉对雌性黄鳝生长性能和形体指标的影响Tab.2 Effects of Antarctic krill meal substitution of fish meal on growth performance and morphometrical parameters of female Monopterus albus

2.2 南极磷虾粉替代鱼粉对雌鳝肌肉及卵巢组织营养组成的影响

由表3可看出, 20%磷虾粉替代组粗蛋白质含量显著高于其他组(P<0.05), 100%替代组粗蛋白含量最低。对照组粗脂肪含量与20%和60%组之间无显著性差异(P>0.05), 但显著高于其他3个替代组(P<0.05)。对照组粗灰分含量显著高于100%替代组(P<0.05), 但与其他组之间无显著性差异(P>0.05)。各组间黄鳝肌肉中水分含量无显著性差异(P>0.05)。

表3 南极磷虾粉替代鱼粉对雌性黄鳝肌肉体成分的影响Tab.3 Effects of Antarctic krill meal instead of fish meal on muscle composition of Monopterus albus (%)

进一步对各组黄鳝卵巢组织营养成分进行分析表明, 随替代水平的升高, 粗蛋白质含量呈逐渐下降趋势, 20%和40%组粗蛋白质含量与对照组之间无显著差异(P>0.05; 表4)。40%组粗脂肪含量显著高于对照组及其他各替代组(P<0.05)。20%组粗灰分含量显著高于对照组(P<0.05), 随替代水平的升高, 粗灰分含量呈下降趋势。80%和100%替代组卵巢水分含量显著高于其他组(P<0.05)。

表4 南极磷虾粉替代鱼粉对雌性黄鳝卵巢组织营养成分的影响Tab.4 Effects of Antarctic krill meal substitution of fish meal on ovary nutrient composition of female Monopterus albus (%)

2.3 南极磷虾粉替代鱼粉对雌鳝肝脏抗氧化及非特异性免疫指标的影响

由表5可以得出, 对照组过氧化氢酶(CAT)活性显著高于100%替代组(P<0.05), 但与其他组之间无显著性差异(P>0.05)。20%替代组超氧化物歧化酶(SOD)活性与对照组及40%替代组之间无显著性差异(P>0.05), 但显著高于60%、80%和100%替代组(P<0.05)。对照组丙二醛(MDA)含量与20%替代组之间无显著性差异(P>0.05), 但显著低于其他水平替代组(P<0.05)。

表5 南极磷虾粉替代鱼粉对雌性黄鳝肝脏抗氧化及非特异性免疫指标的影响Tab.5 Effects of Antarctic krill meal substitution of fish meal on parameters of anti-oxidation and non-specific immunity in liver of female Monopterus albus

非特异性免疫指标检测包括碱性磷酸酶(AKP)、补体C4及免疫球蛋白M(IgM)。对照组AKP活性与20%替代组之间无显著性差异(P>0.05), 但显著低于60%、80%及100%水平替代组(P<0.05)。40%替代组C4含量显著高于其他组(P<0.05), 而对照组与20%组之间无显著性差异(P>0.05)。20%组免疫球蛋白M(IgM)含量与对照组之间无显著性差异(P>0.05), 但显著高于80%及100%替代组(P<0.05)。

2.4 南极磷虾粉替代鱼粉对雌鳝个体生殖力的影响

表6表明, 对照组性腺指数(GSI)与各组之间无显著性差异(P>0.05)。绝对怀卵量(F)随替代水平的升高呈下降趋势, 20%、40%和80%替代组与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。对照组相对怀卵量(RF)显著高于100%替代组(P<0.05), 但与其他组之间无显著性差异(P>0.05)。随磷虾粉替代水平的升高, 卵粒直径有增大趋势, 对照组卵粒直径显著低于其他各组(P<0.05), 其中100%替代组卵粒直径最大, 显著高于对照组和20%替代组(P<0.05)。20%和40%组血清雌二醇含量与对照组之间无显著差异(P>0.05), 但显著高于其他替代组(P<0.05)。

表6 南极磷虾粉替代鱼粉对雌性黄鳝个体生殖力的影响Tab.6 Effect of Antarctic krill meal substitution of fish meal on individual fecundity of female Monopterus albus

3 讨论

3.1 南极磷虾粉替代鱼粉对雌性黄鳝生长性能及形体指标的影响

已有研究表明, 适量的磷虾粉替代鱼粉可能对水产动物的生长无不利影响或有一定的促进作用,而磷虾粉替代高水平或全部的鱼粉可能会导致鱼体的生长性能和饲料效率下降[12]。南极磷虾粉替代鱼粉对大规格银鲳(Pampus argenteus)的生长性能及成活率均无显著影响[6]。在大黄鱼(Larimichthys crocea)中, 磷虾粉替代鱼粉的比例不超过12.4%时, 其体重和特定生长率与对照组无显著差异[16]。南极磷虾粉替代鱼粉比例不超过10%对黄颡鱼的生长以及存活率影响不显著[7]。而在圆斑星鲽中发现, 磷虾粉替代10%—30% 鱼粉能够显著提高其生长性能[12]。同样在黑鲷幼鱼中, 当磷虾粉替代20%—30%的鱼粉时, 其增重明显上升, 而当磷虾粉替代鱼粉比例高于40%时, 其增重率与对照组差异不显著[17]。在本研究中, 当磷虾粉替代鱼粉水平不超过20%时黄鳝的增重率和特定生长率与对照鱼粉组无显著性差异, 但随着磷虾粉替代比例的增加, 黄鳝的增重率呈下降趋势。其原因可能是南极磷虾粉中含有一定比例的几丁质, 几丁质增多会引起动物肠道的损伤, 从而影响饲料在鱼体内的消化吸收[18]。另外, 磷虾粉中含有的氟积累过量也会对鱼体产生一定的毒害[19]。在本实验条件下, 结合雌性黄鳝生长性能以及饲料效率等指标的分析, 饲料中南极磷虾粉替代鱼粉的比例不宜超过20%。

形体指标在一定程度上可以反映鱼类机体的营养健康状况[20]。在三倍体虹鳟[11]中的研究结果表明磷虾粉替代8.55%—57.02%鱼粉对虹鳟的形体指标无显著性影响。在黄鳝[8]中结果表明饲料中添加57.6—115.2 g/kg磷虾粉对黄鳝脏体比存在显著影响, 但对肥满度和肝体比则无显著性影响。这与本实验的研究结果部分相一致。在本实验中, 替代水平对黄鳝的肥满度无显著影响, 但却显著影响雌鳝肝体比和脏体比, 具体原因有待进一步探讨。

3.2 南极磷虾粉替代鱼粉对鱼体体成分的影响

饲料原料的组成能够显著影响鱼体体成分[21]。在不同鱼类南极磷虾粉替代鱼粉的研究中, 对鱼体体成分的测定所得结果不相一致。大菱鲆(Scophthalmus maximus)的研究结果表明不同的南极磷虾粉替代水平对鱼体肌肉营养成分无显著影响[22], 而点带石斑鱼(Epinephelus coioides)幼鱼的脂质水平随着磷虾粉添加水平升高而显著提升[23]。在黄颡鱼中, 随着磷虾粉替代水平的提高, 其鱼体粗蛋白质含量显著下降, 同时还影响肌肉质构以及氨基酸的含量[7]。当磷虾粉替代水平超过40%时, 大西洋鲑(Salmo Salar)肌肉中粗蛋白质水平随着添加比例升高而降低, 低于40%时肌肉中粗蛋白质水平显著升高[24]。在本研究中, 南极磷虾粉替代20%鱼粉时能够显著提高黄鳝肌肉粗蛋白质含量, 但随着替代水平的升高, 粗蛋白含量呈下降趋势, 该结果与圆斑星鲽幼鱼[25]及大西洋鲑[26]中的结果较为相似。肌肉中粗蛋白含量随着磷虾粉添加水平的提高而逐渐下降, 推测可能的原因是由于含磷虾粉的饲料中几丁质、壳聚糖等的升高, 降低了营养物质在鱼体内的消化吸收[25]。

性腺营养成分关系着性腺的发育状况, 其中性腺中的蛋白质和脂质是保证性腺中卵子的充分发育以及产卵后受精、孵化以及仔鱼质量的关键因素。在本研究中, 当南极磷虾粉替代鱼粉比例超过60%时, 黄鳝卵巢组织中的粗蛋白及粗脂肪含量均呈下降趋势, 而水分含量则显著上升。这可能也是由于磷虾粉高替代水平下饲料中的几丁质和氟含量增多,影响了鱼体对营养物质的转运吸收。

3.3 南极磷虾粉替代鱼粉对雌性黄鳝抗氧化及非特异性免疫能力的影响

已有研究表明, 南极磷虾粉富含的虾青素可在一定程度上提高水产动物的抗氧化能力[27]。SOD是机体清除自由基的关键酶, 而MDA是自由基引发的脂质过氧化反应的最终产物, 其与CAT酶活性一起可综合评价水产动物的抗氧化能力。Wei等[10]在大黄鱼的研究中表明, 添加南极磷虾粉替代鱼粉对大黄鱼肝脏组织中的SOD、MDA活性无显著差异, 但总体趋势随着替代水平的上升其活性逐渐下降。在黄鳝中, SOD酶活性在一定的磷虾粉替代比例内显著升高, 但随着替代水平的上升而逐渐下降[8]。在本实验中, 20%磷虾粉替代鱼粉不影响雌性黄鳝肝脏中SOD、MDA以及CAT的活性; 但是随着磷虾粉替代水平的升高, SOD活性显著降低, 而MDA含量显著升高。其原因可能是由于磷虾粉高替代水平条件下饲料中的几丁质和氟含量的增加使鱼体处于应激状态, 其体内的自由基显著增加而导致氧化应激, 影响了细胞正常功能的发挥, 从而降低了抗氧化能力。

水生动物的特异性免疫机制不具备抗体生成的二次反应, 非特异性免疫在水生动物的免疫防御中扮演着最为重要的角色[12]。在本实验中, 黄鳝肝脏中的AKP活性、C4、IgM含量在对照组与20%磷虾粉替代组之间无显著性差异, 但AKP随着替代水平的升高而显著上升, 而C4、IgM含量随着替代水平的升高逐渐下降。这些结果表明, 当磷虾粉替代鱼粉比例不超过20%时不影响黄鳝的非特异性免疫能力, 而过高水平的磷虾粉替代会引起黄鳝非特异性免疫能力的下降。

3.4 南极磷虾粉替代鱼粉对黄鳝生殖力的影响

南极磷虾粉中含有丰富的磷脂(极性脂)和虾青素(非极性脂), 能够提高鱼类的繁殖性能[4,28—30]。研究表明, 饲料中添加一定比例的虾青素可显著提高大西洋鳕(Gadus morhuaL.)的卵子以及仔鱼质量[9]。在黄尾鰤(Seriola quinqueradiata)亲鱼培育阶段的饵料中添加10%磷虾粉可提高黄尾鰤亲鱼卵子质量。在半滑舌鳎亲鱼培育饲料中添加一定比例的磷虾粉, 能够显著提高半滑舌鳎血清中雌二醇含量以及相对产卵量, 但性腺成熟系数却低于对照组[15]。在凡纳滨对虾添加南极磷虾粉替代10%—20%的鱼粉, 可促使凡纳滨对虾性腺指数升高, 在一定程度上影响其繁殖力[30]。在本研究结果中, 20%组雌性黄鳝的血清雌二醇含量以及相对怀卵量与对照组无显著性差异, 但显著高于其他高水平替代组。当磷虾粉替代水平超过80%时, 雌性黄鳝的性腺指数显著下降。这说明饲料中磷虾粉添加过量可能导致过多的氟积累,从而降低鱼体机体的性腺发育迟缓以及怀卵量下降。另外, 随着磷虾粉替代水平的提高, 雌性黄鳝的卵径逐渐增大, 这可能是由于卵巢中水分含量随着磷虾粉替代水平的提高而增加, 从而使得卵径增大。