生物信息学分析鉴定干扰素调节因子7作为早期糖尿病肾病免疫损伤枢纽基因的研究

张冬梅 张丽玲 高利超 朱婷婷

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是世界范围内导致终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)的主要病因。已有多项研究试图阐明DN的发病机制以促进药物研发，从而延缓甚至逆转DN的发展。血流动力学改变、代谢紊乱、免疫失调和滤过屏障受损是DN发生的主要机制[1]。此外，有研究[2]结果表明，肾小管特别是近端肾小管也是DN的损伤部位。进行性肾小管间质纤维化是DN导致ESRD发生、发展的重要机制[3-4]。在尚未表现出明显肾小球损伤的早期糖尿病患者尿液中，可检测到近端肾小管上皮细胞(renal proximal tubular epithelial cell，RPTC)损伤的生物学标志物[5]。免疫失调与DN诱发的肾小管损伤密切相关[6-7]。但早期DN相关肾小管损伤的免疫机制尚不明确。

近年来，高通量测序技术和在线生物信息学数据库的研发为研究人员深入探索疾病的基因改变和潜在致病机制提供了重要手段。本研究团队应用CTD在线数据库(Comparative Toxicogenomics Database，https://ctdbase.org)、NCBI-GEO数据库(The National Center for Biotechnology Information-Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)、ARCHS4数据库(all RNA-seq and ChIP-seq sample and signature search)、R语言软件，以及DAVID 6.8在线生物信息数据库(https://david.hcifcrf.gov)对早期DN小鼠肾小管的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行鉴定。利用京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG；https://www.genome.jp/kegg/pathway.html)通路和基因本体论(Gene Ontology，GO)富集分析识别这些DEGs编码的蛋白质间的相互作用及通路关系，筛选出可能的早期DN相关肾小管损伤的免疫调节枢纽基因，并进一步比较了枢纽基因在高糖刺激的人近端肾小管上皮细胞系(human renal proximal tubular epithelial cell,即HK-2细胞)与对照组中的表达差异，为进一步的机制研究提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 CTD在线数据库筛查DN相关基因 CTD在线数据库提供了关于化学分子与基因或蛋白质相互作用、化学分子或基因与疾病关系的多种信息。通过输入关键词“糖尿病肾病(diabetic nephropathy)”，查找DN相关基因。筛选标准为干扰分数(inference scored)≥10分。

1.2 早期DN小鼠测序数据的获取 本研究中所分析的高通量测序数据检索自NCBI-GEO数据库。检索条件：①关键词，“早期糖尿病肾病(early development of diabetic nephropathy)”。②条目类型，系列(series)。③研究类型，高通量测序基因表达谱分析。④物种，小鼠。⑤肾脏组织细胞定位，RPTC。最终获得由Tang Wanxin(唐万欣)等提供的基于GPL17021 Illumina HiSeq 2500(Mus musculus)平台的GSE95376高通量测序数据。该数据集以RPTC作为研究样本，总共包含4个干预时间点[即连续5 d经小鼠尾静脉注射50 mg/(kg·d)的链脲佐菌素,样本收集时间为注射0、2、4和8周时]共8个样本。

1.3 数据处理及DEGs筛选 ARCHS4数据库是Alexander Lachmann等基于NCBI-GEO、序列读取存档(Sequence Read Archive，SRA；https://ncbiinsights.ncbi.nlm.nih.gov/tag/sra)等数据库开发的公共数据库，具备数据直观探索、交互式可视化的特点，可分析基因表达水平、预测基因生物学功能和蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络关系等。应用ARCHS4数据库的BioJupies功能进一步分析4个干预时间点的DEGs。并利用R语言软件(4.0.2版本)的limma软件包对获得的DEGs进行进一步筛选。将P<0.05，log2(fold change,FC)的绝对值>1作为筛选DEGs的条件，以筛选出不同干预时间点共同的DEGs，并与CTD在线数据库所获的DN相关基因进行维恩图可视化分析，最终得到2个数据库共表达差异基因(co-DEGs)。

1.4 DEGs的PPI构建及模块分析 利用STRING在线工具(https://string-db.org/)识别co-DEGs编码的蛋白质间的相互作用关系，并利用Cytoscape软件(3.7.1版本)的MCODE插件分析出最重要的功能模块Module-1，进一步通过DAVID 6.8在线生物信息数据库对Module1-1中的基因进行GO生物学过程的富集分析。

1.5 DEGs富集分析与核心基因筛选 应用DAVID 6.8在线生物信息数据库对co-DEGs进行GO和KEGG 通路富集分析。利用在线绘图工具(https://www.bioinformatics.com.cn)将富集分析结果进行可视化，以气泡图展示。同时，通过上述富集分析筛选出富集在免疫反应集群中的DEGs，并将富集在Module-1的基因与富集在免疫反应集群中的基因进行维恩图可视化分析，得到重叠的核心基因集群。最后，利用Cytoscape软件的cytoHubba插件的4种不同的计算方法[MCC(Maximal Clique Centrality)、Degree、EPC(Edge Percolated Component)和MNC(Maximum Neighborhood Component)]筛选出该核心基因集群中最关键的枢纽基因。

1.6 核心基因验证

1.6.1 实验试剂 RNA提取试剂盒购自中国成都福际生物技术有限公司，5×All-In-One MasterMix、EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-No Dye购自美国Abcam公司。RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF，100 mmol/L)、磷酸化蛋白酶抑制剂、十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)凝胶制备试剂盒、TBS缓冲液均购自中国武汉赛维尔生物科技有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白上样缓冲液、超敏ECL化学发光底物购自中国合肥兰杰柯科技有限公司。Tris、SDS、Glycine、BSA、TWEEN 20均购自德国Bioforxx公司。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司。干扰素调节因子7(IRF7)抗体购自美国Proteintech公司；GAPDH抗体购自澳大利亚Affinity公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG购自中国武汉赛维尔生物科技有限公司。引物β-actin序列为 5’-AAT CTG GCA CCA CAC CTT CTA CAA-3’,5’GGA TAG CAC AGC CTG GAT AGC AA-3’；引物IRF7序列为5’-CCC AGC AGG TAG CAT TCC C-3’,5’-GCA GCA GTT CCT CCG TGT AG-3’;均由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。

1.6.2 细胞培养 将HK-2细胞置于DMEM培养基(葡萄糖浓度5.5 mmol/L)中，于 37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱内培养，取对数生长期细胞(3×104个/mL)接种于6孔板。以葡萄糖浓度为30 mmol/L的DMEM培养基培养细胞48 h，纳入高糖组; 以葡萄糖浓度为5.5 mmol/L的DMEM培养基培养细胞48 h，纳入对照组。

1.6.3 RNA提取与实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞核心基因表达 应用RNA提取试剂盒分别提取各组HK-2细胞总RNA，应用反转录试剂盒将总RNA反转录合成为cDNA，以2 μL cDNA进行PCR扩增反应，采用 2-ΔΔCt法计算IRF7 mRNA的相对表达量。

1.6.4 蛋白质印迹法检测IRF7蛋白质表达 收集各组 HK-2 细胞加入蛋白质裂解液提取细胞总蛋白质，采用BCA法检测蛋白质浓度，按照每孔30 μg蛋白质样品上样，在80～120 V电压下进行电泳。转膜后加入一抗(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。加入二抗(1∶5 000 稀释)后，37 ℃摇床中孵育1.5 h，进行化学发光显影，扫描记录数据。

1.7 核心基因通路分析 通过KEGG在线分析工具查找核心基因相关信号通路,并通过NCBI数据库查阅该基因与肾脏损伤的相关机制，整合分析并绘制出该核心基因的相关信号通路。

2 结 果

2.1 数据处理及DEGs筛选 应用CTD在线数据库共获得与DN相关的6 576个基因。通过ARCHS4数据库及R语言软件的limma软件包分析GSE95376数据集，发现早期DN小鼠的4个干预时间点共有435个DEGs，其中表达上调的基因130个，表达下调的基因305个。应用ARCHS4数据库绘制关于GSE95376数据集各干预时间点DEGs的火山图显示,干预2周的DN小鼠较对照组有599个上调DEGs，483个下调DEGs，干预4周的DN小鼠较对照组有212个上调DEGs, 444个下调DEGs，干预8周的DN小鼠有1 104个上调DEGs，879个下调DEGs(图1A～1C)。利用在线绘图工具对3个干预时间点的DEGs进行维恩图可视化分析，结果显示共有435个DEGs(图1D)。

A 干预2周的DN小鼠RPTC的DEGs火山图 B 干预4周的DN小鼠RPTC的DEGs火山图 C 干预8周的DN小鼠RPTC的DEGs火山图 D 对3个干预时间点的DEGs进行维恩图可视化分析

2.2 DEGs的PPI构建及模块分析 将上述CTD在线数据库DN(CTD-DN)相关基因与GSE95376数据集3个干预时间点co-DEGs进行维恩图可视化分析，筛选出229个co-DEGs(图2A)。利用STRING在线工具分析该229个co-DEGs编码的蛋白质间的相互作用关系，并通过Cytoscape软件可视化，提示该229个co-DEGs之间联系密切。使用MCODE插件筛选出最重要的模块Module-1，提示该模块中的26个基因之间关系紧密，颜色越深的基因在模块中的作用越关键(图2B)。通过DAVID在线分析工具对该模块中的所有基因进行GO生物学富集分析，发现26个基因的主要功能：①对病毒的防御反应(包括IFIH1、BST2、RSAD2、DDX58、STAT2、ISG15、IFIT1、OASL1、IFIT3、IFIT2、OASL2)；②应对病毒(包括IFIH1、BST2、RSAD2、DDX58、IFIT1、OASL1、IFIT3、IFIT2、OASL2)；③免疫系统过程(包括IFIH1、BST2、RSAD2、DDX58、IRF7、IFIT1、OASL1、IFIT3、IIGP1、HERC6、IFIT2、OASL2)；④先天免疫反应(包括IFIH1、BST2、RSAD2、DDX58、IRF7、IFIT1、OASL1、IFIT3、IIGP1、HERC6、IFIT2、OASL2)；⑤细胞对IFN-β的反应(包括GBP6、STAT1、IGTP、IRGM2、IFIT1、IFIT3、IIGP1)。

A 对CTD-DN相关基因和3个干预时间点co-DEGs进行维恩图可视化分析 B 通过MCODE插件分析来自功能最重要模块Module-1的DEGs编码的蛋白质的相互作用网络图

2.3 co-DEGs功能富集分析与核心基因筛选 利用DAVID在线分析工具对上述229个co-DEGs进行KEGG通路富集分析，结果显示DEGs主要富集在肝炎病毒、流行性感冒病毒和疱疹病毒感染，以及破骨细胞分化、脂肪细胞内脂解的调节、2型糖尿病及胰高血糖素信号通路等(图3A和表1)。GO富集分析结果显示，基因主要富集于病毒防御反应、免疫系统过程、先天性免疫反应、脂质及类固醇代谢过程、防御病毒、调节细胞增殖及基因表达等生物学过程等(图3B和表2)。功能最重要的模块Module-1的基因主要富集在免疫相关生物学过程中，进一步将Module-1中的基因与富集在免疫应答集群中的DEGs进行维恩图可视化分析，得到11个参与免疫应答的关键DEGs:IRF7、IIGP1、IFIT3、OASL1、DDX58、IFIT2、IFIT1、IFIH1、RSAD2、HERC6和BST2。通过Cytoscape的cytoHubba插件筛选出免疫应答集群中最关键的核心基因并将其可视化，应用4种计算方法(MCC、Degree、EPC、MNC)得出排名顺序，均提示IRF7位于这11个差异基因相互作用的核心位置(表3)。

A co-DEGs的KEGG通路富集分析 B co-DEGs的GO-BP富集分析

表1 co-DEGs前10个显著富集的KEGG通路

表2 co-DEGs前10个显著富集的GO生物学过程

表3 4种不同计算方法筛选核心基因的排序

2.4 核心基因的验证 通过核心基因的筛选，IRF7被鉴定为早期DN相关肾小管损伤的关键DEGs。体外实验结果显示，高糖组IRF7 mRNA相对表达量为1.633±0.058，显著高于对照组的1.153±0.087(P<0.05)。IRF7蛋白质相对表达量为0.127±0.018，显著高于对照组的0.060±0.005(P<0.05)。

2.5 核心基因的通路分析 应用KEGG在线工具，输入关键词IRF7，选择其与炎症、凋亡及免疫相关的信号通路，包括Toll样受体信号通路(hsa04620)、NOD样受体信号通路(hsa04621)和RIG-Ⅰ样受体信号通路(hsa04622)，并结合NCBI-GEO数据库查阅IRF7导致肾脏损伤的相关信号通路，整理出IRF7参与炎症、凋亡及抗病毒的信号通路(图4)，发现细胞在病毒、细菌及内源性损伤相关分子的刺激下，可通过不同途径刺激IRF7表达，并最终参与Ⅰ型IFN及N-乙酰葡萄糖胺转移酶的产生，从而参与炎症、凋亡、抗病毒等过程。

注：IRF7主要富集在Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路和RIG-Ⅰ样受体信号通路，参与炎症、凋亡及抗病毒等生物学过程。NOD2为核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2；MAVS为线粒体抗病毒信号蛋白；TRIF为IFN-β TIR结构域衔接蛋白；TRAF3/6为肿瘤坏死因子受体相关因子3/6；TBK1为TANK结合激酶1；IKKε为IκB激酶；TLR2/3/4/5/7/8/9为Toll样受体2/3/4/5/7/8/9；MyD88为髓样分化因子88；TIRAP为Toll IL-1受体域衔接蛋白；RIP2为受体相互作用蛋白2；PI3K为磷酸酰肌醇-3激酶；rac为Rac家族小GTP酶；BTK为布鲁顿酪氨酸激酶；LPS为脂多糖；DAMPs为损伤相关分子模式；IRAK1/4为IL-1受体相关激酶1/4；LFNG为O-岩藻糖肽3-β-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶

3 讨 论

本研究通过从CTD数据库下载DN相关基因，以及从NCBI-GEO数据库提取DN小鼠的肾小管高通量测序数据，利用ARCHS4在线分析网站及生物信息学技术鉴别出2个数据库重叠的229个co-DGEs，进行PPI分析及模块分析。结果显示，Module-1模块的co-DEGs基因主要富集在免疫反应、固有免疫系统等生物学功能上。进一步行GO和KEGG通路富集分析，结果显示co-DEGs主要富集在病毒感染及代谢相关途径，如甲型H1N1流行性感冒病毒感染、单纯疱疹病毒感染、破骨细胞分化、脂肪分解调节及胰高血糖素信号通路等。GO富集分析提示这些DEGs大多富集在免疫相关的生物过程，如免疫系统过程、先天性免疫反应、病毒防御反应、细胞对IFN-β的反应等。多项研究[7-12]结果表明，免疫反应及免疫系统对DN的发生、发展有重要影响，巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞等免疫细胞均参与到DN的病理生理过程中。通过Toll样受体信号等先天性免疫相关通路可检测糖尿病过程中产生的内源性危险相关分子模式，通过NF-κB信号通路诱导无菌性的小管间质炎症反应[7]。上述结果表明，筛选出的DEGs可能通过免疫介导的肾小管损伤影响 DN 的进展。

为了进一步分析出免疫相关的核心基因，本研究将Module-1中的基因与富集在免疫应答集群中的DEGs进行维恩图可视化分析，筛选出IRF7、IIGP1、IFIT3、OASL1、DDX58、IFIT2等11个重要的参与免疫应答的DEGs。在通过cytoHubba 插件计算得到的基因中，IRF7占据网络枢纽位置。IRF7是IFN调节因子基因编码的相关蛋白家族成员之一,其具有经典的螺旋-转角-螺旋结构，最重要的生物学功能是诱导Ⅰ型IFN的产生，参与机体抗病毒及免疫反应[13]。IRF7参与多种疾病的发生、发展，包括自身免疫性疾病[14]、呼吸道炎症[15]、肿瘤[16]、自生免疫性胰腺炎[17]及糖尿病[18]等。IRF7在肾脏免疫损伤中同样扮演重要角色。在猪肾上皮细胞(PK15)中IRF3/IRF7过表达可通过TLR4信号通路减弱炎症反应[19]。在CKD中，增多的循环RNA作为内源性损伤分子显著提高NF-κB、IRF3和IRF7水平，进而调节CKD的免疫炎症反应[20]。在5/6肾切除大鼠模型中，IRF7的表达水平在肾切除后15、60 d均明显升高，并伴随着进行性的高血压和蛋白尿、肌酐水平升高及严重的肾小球和小管间质损伤，其机制可能是通过激活TLR2/4/5-MyD88-TRAF6-IRF7信号通路导致炎症因子释放及促进炎症小体形成[21]。本研究通过生物信息学分析发现，在早期DN小鼠RPTC中，IRF7表达水平显著升高，且位于免疫应答网络的核心位置，并进一步在HK-2 细胞的体外实验中得到证实，提示IRF7与早期DN免疫损伤密切相关。

本研究进一步对IRF7进行了KEGG相关通路分析，发现其主要通过Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路和RIG-Ⅰ样受体信号通路参与炎症、凋亡及免疫反应等。Toll样受体是激活IRF7的重要模式识别受体之一。TLR2可在炎症性单核细胞和骨髓来源的巨噬细胞中被内化并激活IRF1、IRF3和IRF7[22-23]，同时TLR3、TLR7、TLR9、RIG-Ⅰ、NOD等信号通路在病原体刺激下也可激活IRF7[24]。在DN中，受损或死亡的细胞可释放一些内源性损伤相关分子(如DAMPs)[25]，其可与特定的Toll样受体相互作用诱导先天性免疫反应。在DN中，肾脏TLR2、TLR4水平明显升高[26-27];损伤相关分子可激活TLR2、TLR4，从而形成肌小体复合物并诱导TRAF6的活化，进而导致炎症介质相关基因表达。持续免疫介导的慢性炎症可导致肾小球、肾小管及肾间质损伤，最终导致肾脏纤维化病变、肾功能恶化和ESRD[25]。本研究结果提示，在早期DN患者的RPTC中, IRF7表达水平显著增高，同样在高糖刺激的HK-2细胞中IRF7表达水平也明显升高，并通过生物信息学分析鉴定出IRF7具有重要的免疫应答功能，KEGG通路分析及经数据库信息筛查进一步明确了IRF7参与肾脏损伤的潜在机制，提示IRF7可作为治疗DN的早期干预靶点。

综上所述，本研究应用生物信息学方法鉴定出IRF7为早期DN肾小管免疫应答的枢纽基因。这一结果在HK-2细胞的体外实验中得到了进一步的证实。KEGG通路分析阐述了IRF7参与DN相关肾损伤的潜在机制。这些结果为进一步深入探索早期DN的免疫损伤相关分子机制提供了依据，并为DN的早期治疗挖掘了新的潜在靶点。