狼疮性肾炎潜在蛋白质生物标志物的生物信息学分析

刘南池,王雁飞,周燕,魏玉娇,秦双,马瑞霞

(青岛大学附属医院肾病科,山东 青岛 266000)

狼疮性肾炎(LN)是系统性红斑狼疮(SLE)病人常见且严重的并发症，也是导致肾衰竭和病人死亡的重要原因[1]。LN的发病除了与免疫混合物的形成、细胞因子异常有关以外，还具有明显的遗传相关性。然而，迄今确定的众多与LN相关基因只解释了20%的疾病遗传性[2]。缺失的遗传性可能来自基因和环境(病毒感染、药物作用等)之间复杂的相互作用，以及基因表达的调控被破坏等[3]。因此，探究LN相关的遗传标志物对疾病的早期诊断和预后评估有重要意义。随着生物信息学分析和基因芯片技术的发展，整个转录组的基因表达谱分析越来越多地被用于探索致病相关基因、对不同类型的疾病进行分类和预测临床转归[4]。然而，目前对SLE和LN的生物信息学分析研究还很少。本研究选取GSE32591的数据集，确定LN病人中差异表达基因(DEGs)，并对DEGs进行基因本体(GO)分析和KEGG分析，使用Cytoscape软件构建DEGs的蛋白质相互作用(PPI)网络，预测其中的核心基因及发挥调控作用的转录因子，为探讨LN的发生发展提供依据。

1 材料与方法

1.1 数据采集

以“Lupus Nephritis”为关键词，在基因表达综合(GEO)数据库[5](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索数据集，筛选标准：①芯片研究类型为表达谱芯片；②无其他干预措施；③样本分组为正常组和疾病组；④提供基因符号(Gene symbol)的注释信息。最终选取了编号为GSE32591的项目，其数据为通过微阵列分析的微分解的肾脏活检组织(来源于美国密西根大学)的转录组，共包括93例样本。其中取自肾小管间质组织的LN病人样本32例，正常对照组样本15例；取自肾小球组织的LN病人样本32例，正常对照组样本14例。该数据集微阵列分析是基于GPL14663 Affymetrix GeneChip Human Genome HG-U133A Custom CDF平台进行的。

1.2 DEGs确定

通过GEO2R程序[6]分别确定LN样本与正常样本肾小管间质和肾小球组织中的DEGs。筛选标准设定为矫正后P值<0.05，|logFold Change|≥1。然后应用Venn图将肾小球DEGs和肾小管间质DEGs取交集。

1.3 功能和通路富集分析

使用DAVID[7](http://david.ncifcrf.gov/)对肾小球组织DEGs和肾小管间质DEGs交集部分的DEGs进行GO分析和KEGG分析，明确基因富集的通路和功能，设置阈值为P<0.05，错误发现率(FDR)<0.05。GO[8]分析按照生物途径、分子功能和细胞定位对基因进行注释分类，KEGG[9]分析旨在通过代谢通路的分析诠释基因功能。

1.4 PPI网络的构建

使用互作基因数据库的检索工具STRING[10](https://string-db.org/cgi/)构建相互作用基因的网络，输入多个基因、蛋白质名称，得到总结了特定蛋白质组预测关联的网络视图。通过Cytoscape软件将PPI网络可视化，隐藏无相关联系基因，得到合理的布局。

1.5 网络分析

在PPI网络中，使用Cytoscape的cytohubba插件预测核心基因[11]，结合12种算法的结果合并分析，选出其中出现频数最高的基因确定为核心基因。使用Cytoscape软件的MCODE[12]插件在庞大的蛋白网络中进行基因功能模块聚类构建，确定高度连接的基因集。这些高度互连的区域被称为子网络。本研究设定影响子网络大小的节点评分截断值(NSC)=0.2，K-Core=2[13]。使用Cytoscape软件的iRegulon插件预测子网络的转录因子[14]，所选的转录因子信息来自SwissRegon、Jaspar、Encode、Transfac和Hmer数据库[15]。在分析结果中选取归一化富集分数(NES)>10的转录因子，并绘制网络图。

1.6 核心基因差异表达分析

在Nephroseq[16](http://www.nephroseq.org)中依次检索确定的核心基因，设定LN为筛选条件，选择相关研究，进行Meta分析综合比较。

2 结 果

2.1 LN相关DEGs

在GSE32591的数据中，通过GEO2R确定了LN病人和正常对照组之间的DEGs，在肾小管间质样本中共确定了130个DEGs，其中有25个下调基因，105个上调基因；在肾小球样本中共确定了352个DEGs，其中102个下调基因，250个上调基因。将肾小球和肾小管间质的DEGs进行比较，使用Venn图取交集，确定了66个共有的DEGs(图1)，其中11个下调基因，55个上调基因。

G：肾小球样本的DEGs；T：肾小管间质样本的DEGs。图1 DEGs的Venn图

2.2 功能和通路富集分析

GO分析显示，在生物学过程层面，基因显著富集于防御病毒、对病毒的反应、Ⅰ型干扰素(IFN)信号通路、先天免疫反应、病毒基因组复制的负调控、干扰素-γ介导的信号通路、对干扰素-β的反应、对干扰素-α的反应8个方面，而在细胞组分、分子功能层面未发现显著富集。KEGG分析显示，有9个基因参与甲型流感，8个基因参与单纯疱疹病毒感染。见表1。

表1 GO和KEGG分析结果

2.3 PPI网络

使用STRING构建PPI并通过Cytoscape软件可视化，在网络中，循环节点代表基因，两个节点之间的连线代表基因之间的相互作用(图2)。此网络包括60个基因点和432条相互作用线，其中52个上调基因，8个下调基因。可见，在确定的66个DEGs中有6个基因未参与构成网络；并且在LN病人DEGs中，以上调表达的基因为主。

红色为上调基因，共52个；蓝色为下调基因，共8个。图2 PPI网络

2.4 网络分析

2.4.1核心基因 应用cytohubba的12种算法最终预测2’-5’-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)、IFIT3、三联基序22(TRIM22)、IFIT1(频数分别为8、7、7、6)为核心基因。见表2。在MCODE插件的分析结果中，选定了评分最高的一组基因群集(MCODE评分为24.72)作为本次的研究对象，共包括26个基因、309条相互作用关系连线。在此功能模块中，26个基因全部为表达上调的基因，且高度相互连接，在网络中起到了重要作用(图3)。其中，作用最强的基因为TRIM22、磷脂加扰酶1(PLSCR1)。

表2 cytohubba的12种算法及结果

圆形：基因，面积大小代表作用程度强弱；蓝色：作用较强的基因；橙色：作用较弱的基因。图3 核心基因子网络

2.4.2转录因子 用Cytoscape 的iRegulon插件对子网络中26个关键基因的转录因子进行分析，结果显示，NES>10的因子分别为信号传导及转录激活因子2(STAT2)(NES=17.482，靶向=25)和STAT1(NES=16.109，靶向=23)。二者对子网络中的大部分基因起直接调控作用(图4)。

紫色表示基因，绿色表示转录因子。图4 转录因子网络图

2.5 核心基因的差异表达分析

用Nephroseq进一步验证4个核心基因的表达，证实IFIT1、IFIT3、TRIM22和OAS1在LN样本和正常样本中的表达存在显著差异，并且皆表现为过表达。表明IFIT1、IFIT3、TRIM22以及OAS1是LN中重要的上调基因。

3 讨 论

本研究对DEGs的GO分析显示，LN病程与病毒入侵有关，提示病毒免疫与自身免疫具有相关性。在慢性病毒感染期间，CD8+T细胞在抗原暴露和CD4+T细胞缺乏的共刺激下耗尽衰竭，不但使得病毒清除过程受阻碍，同时也影响了自身免疫性疾病的进展[17]。因此，在LN中病毒免疫与自身免疫密不可分。GO分析还显示，IFN参与疾病进程，IFN是细胞对各种不同的刺激(包括接触病毒)的反应所产生的一些特殊的蛋白质或糖蛋白，除了诱导产生抗病毒蛋白外，还可调节许多细胞功能[18]。在SLE病人中，免疫复合物诱导浆细胞样树突状细胞(pDCs)产生IFN，刺激B细胞分化为浆细胞，并随着中性粒细胞和髓系细胞的激活而发展为特异性组织(如肾脏)和全身炎症[19]。本研究发现的核心基因IFIT1、IFIT3、TRIM22、OAS1皆为IFN诱导基因，提示它们可能通过影响IFN参与LN发病。

核心基因IFIT1与IFIT3皆为含有四肽重复序列的干扰素诱导蛋白家族成员，属于IFN系统。IFIT所编码的蛋白受IFN诱导产生，并且主要由IFN-α/β诱导。IFIT家族成员通过多种机制调节免疫反应，限制病毒感染，包括限制病毒RNA翻译[20]。有研究显示，当IFIT1与IFIT3相互作用时，可以增强其抗病毒的活性[21]。研究表明，LN中IFIT1表达与足细胞损伤有关，尽管二者之间的机制尚不清楚，但IFIT1的表达与足细胞结构蛋白(包括F-肌动蛋白、肾素、podocin)之间的反向关联已被证明，提示IFIT1可能参与了LN的发病[22]。OAS1是由干扰素诱导并编码合成2’-5’-寡腺苷酸的核心基因，可激活潜在的核糖核酸酶L，从而导致病毒RNA降解并抑制病毒复制。除抗病毒外，已证明OAS1与SLE密切相关[23]，并在一定程度上影响疾病活动度。本文结果与以上研究结果一致，进一步证明了这些基因在LN中具有重要作用。

位于MCODE子网络中核心的PLSCR1和核心基因TRIM22皆为干扰素诱导基因，可能介导干扰素的抗病毒作用，并与免疫应答密切相关。目前，尚无充足证据证明TRIM22在LN病程中具有直接作用，而PLSCR1是细胞激活过程中参与磷脂酰丝氨酸外化调控的关键分子，被证明是SLE血栓前倾向的重要因素之一[24]。本研究提示二者在LN中起正向调控作用，可能成为新的生物学靶点。

转录因子是调节基因表达的一组蛋白。本文研究结果显示，STAT1和STAT2是STAT家族的成员。该蛋白可以被各种配体激活，包括干扰素-α、干扰素-γ、表皮生长因子、血小板源生长因子和白细胞介素6。研究表明，STAT-Janus激酶信号通路对SLE至关重要，该通路激活导致STAT1的磷酸化和核移位，从而诱导细胞因子信号抑制物1和3的表达[25]，导致细胞因子失调，这也是LN的重要标志。目前正在研究的小分子JAK抑制剂用于SLE治疗机制可能是由于它们抑制STAT蛋白磷酸化。本研究结果显示，STAT1和STAT2对LN致病基因具有调节作用，提示抑制由STAT介导的下游信号传导是LN有价值的治疗选择。

本文选择数据集为GSE32591，由于样本含量少，故在DEGs的富集分析中，未得到GO分析在细胞组分、分子功能层面上显著的功能富集， LN的发生发展在基因层面的机制需扩大样本量进一步研究。另一方面，该数据集的实验样本来源于美国人，与中国病人的基因表达有一定的差异，LN在不同人种间有不同的发病模式，因此，选择中国LN病人的数据进行基因层面的探索很有必要。

综上所述，LN在肾小球和肾小管间质中共有的DEGs有66个。GO分析和KEGG分析表明，DEGs在防御病毒、甲型流感中显著富集。在构建的PPI网络中预测得到4个核心基因和2个转录因子。本文结果为确定LN诊断和治疗的生物标记物提供了依据。