AML病人骨髓miRNA-106b-5p和Rab10表达及意义

徐凌悦,谢文杰,王智超,管洪在

(青岛大学医学部医学检验学系,山东 青岛 266071)

急性髓细胞白血病(AML)是一种严重的血液系统恶性肿瘤，常见于成年人，在儿童血液病中排名第二，其特征是未成熟髓系细胞异常增殖和分化障碍，幼稚细胞在骨髓和外周血中大量累积[1-5]。microRNA(miRNA)是大约22个核苷酸的小RNA分子，可与目标mRNA的3′-UTR结合，在转录水平负调节目标基因的表达[6-9]。miRNA参与关键的生物过程，包括细胞的发育、分化、应激反应、凋亡和增殖等，特定的miRNA表达模式与造血和肿瘤相关[10-12]。miRNA-106b-5p属于miRNA家族，研究表明在多发性骨髓瘤病人中其表达水平升高[13]。Rab10蛋白是Ras超家族中具有鸟苷三磷酸酶功能的成员之一，在多种疾病的发生发展中发挥重要作用[14]。近几年的研究显示，Rab10蛋白在肿瘤细胞的增殖、迁移和和信号转导等方面至关重要[15]。但是miRNA-106b-5p与Rab10蛋白的关系目前尚不清楚。因此，本研究通过检测miRNA-106b-5p和Rab10在AML病人骨髓中的表达情况，并分析二者的相关性，探讨二者表达的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象

AML病人73例，为2020年10月—2021年8月于青岛大学附属医院血液科就诊病人，诊断均符合第4版《血液病诊断及疗效标准》[16]。73例病人，男34例，女39例，年龄15～85岁，平均(46±17)岁；初诊病人(初诊组)31例(包括M1亚型2例，M2亚型8例，M3亚型11例，M4亚型4例，M5亚型6例)，完全缓解病人42例(缓解组)。以同期在青岛大学附属医院血液科进行骨髓移植的健康供者15例作为对照组，其中男4例，女11例，年龄15～69岁，平均(35±19)岁。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂

低温高速离心机(德国Eppendorf公司)；紫外线分光光度计(美国ABI公司)；7500型Real Time PCR扩增仪(美国ABI公司)；Ficoll人淋巴细胞分离液、PBS缓冲液(北京索莱宝科技公司)；TRIzol(美国Invitrogen公司)；miRNA 1stStrand cDNA Synthesis Kit(by steam-loop)、HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)。

1.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miRNA-106b-5p和Rab10表达

使用肝素抗凝管采集AML病人及健康对照者新鲜骨髓样本2 mL，用Ficoll人淋巴细胞分离液分离出样本中单个核细胞，用TRIzol提取细胞中总RNA。使用分光光度计检测RNA的浓度后，应用miRNA 1stStrand cDNA Synthesis Kit(by steam-loop)或者HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒进行miRNA的逆转录，生成cDNA(茎环法，严格按照说明书进行操作)。采用SYBR Green荧光染料法，以cDNA为模板，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒于Real Time PCR扩增仪上进行扩增。引物均由华大基因公司合成，序列见表1。采用2-△△CT方法计算目的基因相对表达水平。

表1 RCR所用引物及其序列

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 各组骨髓中miRNA-106b-5p和Rab10表达的比较

对照组、初诊组、缓解组间miRNA-106b-5p和Rab10相对表达量比较差异有显著性(F=16.956、6.094，P<0.05)；初诊组二者表达较对照组显著增高，缓解组较初诊组显著下降(t=2.122～6.608，P<0.05)。见表2。初诊组各亚型之间miRNA-106b-5p和Rab10的表达差异无显著性(P>0.05)。见表3。动态观察3例病人治疗前后miRNA-106b-5p和Rab10表达的变化，经治疗完全缓解后病人骨髓中二者的表达水平较初诊时均显著降低(t=3.533、5.014，P<0.05)。见表4。

表2 各组骨髓中miRNA-106b-5p和Rab10相对表达量的比较

表3 初诊组各亚型miRNA-106b-5p和Rab10相对表达量比较(中位数(四分位数))

表4 3例病人治疗前后miRNA-106b-5p和Rab10相对表达量的比较

2.2 miRNA-106b-5p与Rab10表达的相关性

本研究先使用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRcode(http://mircode.org/index.php)和miRDB(http://www.mirdb.org/cgi-bin/search.cgi)等miRNA靶基因预测工具对miRNA-106b-5p的靶向mRNA进行预测，取交集后得到了与miRNA-106b-5p相关性最强的靶基因Rab10。Spearman秩相关分析显示，初诊AML病人miRNA-106b-5p表达与Rab10表达呈正相关(r=0.919，P<0.05)。

2.3 miRNA-106b-5p和Rab10表达与初诊AML病人临床指标的相关性

初诊AML病人31例，骨髓原始细胞比例≤50%和>50%者分别为11例和20例，血红蛋白含量为91(75～107)g/L，血小板数为64(24～133)×109/L，白细胞数为7.5(2.2～24.3)×109/L。初诊AML病人miRNA-106b-5p、Rab10的表达水平与骨髓原始细胞比例、白细胞数、血小板数及血红蛋白含量均无相关性(r=-1.253～0.522，P>0.05)。

2.4 miRNA-106b-5p和Rab10表达与初诊AML病人染色体核型的关系

本文31例初诊AML病人中有15例进行了染色体核型分析，其中6例病人染色体核型异常(49,XX,+8,+13,+21[6]/46,XX[4]；47,XY,+1,der(1,16)[10]；46,XY,t(8;21)(q22;q22)[10]；46,XX,t(15;17)(q22;q21)[10]；47,XX,+8[2]/46,XX[18]；47,XY,+10[7]/46,XY[3])。根据初诊组中miRNA-106b-5p表达水平的中位数(1.384)将进行染色体核型分析的15例病人分为miRNA-106b-5p高表达组(7例)和低表达组(8例)；根据初诊组中Rab10表达水平的中位数(1.058)将上述15例病人分为Rab10高表达组(7例)和低表达组(8例)。Fisher确切概率法分析显示，染色体核型异常病人(6例)miRNA-106b-5p、Rab10的表达水平与核型正常病人(9例)相比较差异均无显著性(P=0.608、0.315)。见表5。

表5 miRNA-106b-5p和Rab10表达与初诊AML病人染色体核型的关系(例(χ/%))

3 讨 论

AML是成人最常见的急性白血病，是一种高度异质性的疾病，以未成熟骨髓细胞的异常增殖和分化为主要特征。它是儿童和成人常见的血液疾病类型，每年都会影响近300万人[17-19]。目前AML的常规治疗方法有化疗和骨髓移植(或造血干细胞移植)，然而从AML的诊断时间与发病率和死亡率来看，有待探索新的诊断及治疗手段[20]。随着下一代测序和基因突变分析技术的发展，已经出现了几种新的治疗策略以尽量减少常规疗法的缺陷[21-22]，其中之一即为靶向药物治疗，因此，为AML的诊断及治疗寻找新的靶点至关重要[23-25]。miRNA是短的非编码RNA，它通过直接调控靶mRNA影响细胞分化、增殖等过程。在包括AML在内的许多癌症中，已鉴定出相关的miRNA表达；此外，miRNA还有作为生物标志物的潜能[26]。本研究主要检测AML病人骨髓中miRNA-106b-5p和Rab10的表达并探讨其临床意义。

本研究结果显示，在疾病的不同阶段miRNA-106b-5p及Rab10的表达差异有显著意义，与健康对照组相比，初诊AML病人骨髓样本中miRNA-106b-5p及Rab10的表达水平明显增高，完全缓解后二者表达水平显著降低，表明miRNA-106b-5p及Rab10的异常表达与AML的发生发展密切相关，通过检测二者表达水平可以监测AML病人的病情。在其他恶性疾病中，miRNA-106b-5p的异常表达也影响疾病的发生发展。例如，miRNA-106b-5p通过调节组织蛋白酶A(CTSA)的表达抑制结直肠癌的转移[27]；miRNA-106b-5p在肾细胞癌病人中表达升高，并通过激活β-catenin信号传导增强肾细胞癌的侵袭性[28]；miRNA-106b-5p高表达与肾细胞癌病人预后不良相关[29]。为明确miRNA-106b-5p在AML中是否是通过miRNA-mRNA通路来影响疾病的发生发展，我们使用生物信息学技术预测发现，miRNA-106b-5p的下游靶基因Rab10受其调控。本文秩相关分析结果也初步证明两者之间存在相关性。Rab10发挥着重要的细胞内生物学功能[30]。LI等[31]研究发现，在AML骨髓细胞中牛磺酸上调基因1(TUG1)通过调节miRNA-193a-5p/Rab10轴调控AML细胞的生存和凋亡。FAN等[32]的研究表明，Rab10通过miRNA203-Rab10在AML细胞的增殖和凋亡中起关键的调节作用。Rab10与肿瘤的发生发展密切相关，影响肿瘤细胞增殖、凋亡、分化与转移，可能成为肿瘤治疗的潜在靶点[33]。以上研究结果表明，miRNA-106b-5p及Rab10可以作为AML诊断和预后的潜在生物学标志物。

本文研究结果显示，染色体核型异常的初诊AML病人骨髓中miRNA-106b-5p及Rab10的表达水平与核型正常者相比差异无统计学意义，表明miRNA-106b-5p及Rab10的表达与初诊AML病人染色体异常无关。本研究结果还显示，miRNA-106b-5p及Rab10的表达水平与初诊AML病人骨髓原始细胞比例、血红蛋白含量、白细胞数以及血小板数等临床指标无关，这与YANG等[34]的研究结果相一致。

综上所述，miRNA-106b-5p和Rab10在AML病人骨髓中的表达水平明显增高，完全缓解后又显著降低，因此二者可用于监测AML的病情，也为AML的疾病诊断及病情判断提供了新的生物学标志物。miRNA-106b-5p和Rab10的表达与AML亚型无显著相关性，可能与本研究各亚型病人的样本量小有关。生物信息学预测和相关性分析结果表明，miRNA-106b-5p可能通过调节Rab10的表达在AML中发挥作用，但其作用机制尚不完全清楚。在今后的研究中我们将扩大样本量，进行一系列细胞功能实验来进行验证。