解热颗粒质量标准研究*

2023-01-28翟巧利麦格皮热提阿不力米提时扣荣

中国药业 2023年1期

翟巧利，麦格皮热提·阿不力米提，李媛，刘娟，范伟，时扣荣△

（1.上海中医药大学附属第七人民医院，上海 200137；2.新疆维吾尔自治区莎车县维吾尔医医院，新疆喀什 844700）

解热方为上海中医药大学附属第七人民医院老中医唐英的临床经验方，以疏风清热解毒为法遣药组方，由鸭跖草、大青叶、四季青、荆芥、紫苏叶5味中药材组方。方中，鸭跖草为君药，味甘，性寒，有清热解毒、利水消肿的功效。大青叶为臣药，味苦，性寒，有清热解毒、凉血消斑的功效。四季青味苦，性凉，有清热解毒、消肿祛瘀的功效；荆芥性平温，有疏风解表、透疹消疮的功效，共为佐药。紫苏叶为使药，味辛，性温，有解表、散寒、行气、和胃的功效。诸药合用，共奏疏风解表、清热解毒功效，用于治疗属外感风热表证的上呼吸道感染。全方组方严密，君臣佐使配伍合理，药味简练，功效专著，临床疗效明显。解热方的临床使用剂型为汤剂，存在口感欠佳、保质期短、不便贮存和运输等缺点。应用现代化技术将汤剂优化为颗粒剂，可更好地发挥疗效，方便患者服用及携带。本研究中建立了解热颗粒的质量标准，采用薄层色谱（TLC）法对制剂中大青叶和四季青进行定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定制剂中长梗冬青苷的含量。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配有蒸发光散射检测器；BSA124S型电子天平（德国赛多利斯公司，精度为万分之一）；KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为500 W，频率为50 kHz）；聚酰胺薄膜（国药集团化学试剂有限公司）；硅胶G板（青岛海洋化工厂分厂）；DHG-9055A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；HH数显恒温水浴锅（常州国宇仪器制造有限公司）。

1.2 试药

长梗冬青苷对照品（批号为111868-201202），靛蓝对照品（批号为110716-201612），靛玉红对照品（批号为110717-200204），均购于中国食品药品检定研究院，含量均不低于98%；解热颗粒（医院制剂，沪药制备字Z20210046000，批号分别为201001，201002，201003）；缺大青叶、四季青阴性样品均由上海万仕诚药业有限公司制剂室自制；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水；鸭跖草（批号为20200526-1），大青叶（批号为20200710-1），四季青（批号为191123-1），荆芥（批号为20200714-1），紫苏叶（批号为20200804-1），均购于上海万仕诚药业有限公司，经上海中医药大学附属第七人民医院药学部副主任中药师公丕君鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

大青叶［1-3］：取样品适量，研细，取5 g，加三氯甲烷20 mL，加热回流1 h，滤过，滤液浓缩至1 mL，作为供试品溶液。另取靛蓝对照品和靛玉红对照品，加三氯甲烷制成每1 mL各含1 mg的混合对照品溶液。按解热颗粒制备工艺制备不含大青叶的阴性样品，依法制备缺大青叶的阴性对照品溶液。照2020年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC法试验，吸取上述3种溶液各5µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-丙酮（5∶4∶2，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干。供试品溶液色谱中，在与靛蓝和靛玉红混合对照品溶液色谱相应位置分别显相同的蓝色斑点和浅紫红色斑点，斑点清晰，分离效果较好，且阴性对照无干扰。色谱图见图1 A。

四季青［4］：取样品适量，研细，取5 g，加乙酸乙酯20 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取长梗冬青苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的对照品溶液。按解热颗粒制备工艺制备不含四季青的阴性样品，依法制备缺四季青的阴性对照品溶液。照2020年版《中国药典（四部）》通则0502 TLC法试验，吸取上述3种溶液各4µL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（7∶1∶0.2，V/V/V）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品溶液色谱中，在与长梗冬青苷对照品溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点，斑点清晰，分离效果较好，且阴性对照无干扰。色谱图见图1 B。

1.阴性对照品溶液（缺大青叶、四季青）2.对照品溶液（靛蓝和靛玉红、长梗冬青苷）3-5.供试品溶液（批号分别为201001，201002，201003）A.大青叶B.四季青图1薄层色谱图1.Negative reference solution（lacking Isatidis Folium and Ilicis Chinensis Folium，respectively）2.Reference solution（indigo and indirubin，pedunculoside，respectively）3-5.Test solution（batch number：201001，201002 and 201003）A.Isatidis Folium B.Ilicis Chinensis FoliumFig.1 TLC chromatograms

2.2 含量测定［4-5］

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：10%异丙醇甲醇（A）-10%异丙醇水溶液（B），梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；进样量：10 µL和20 µL（对照品溶液），10 µL（供试品溶液）。理论板数按长梗冬青苷峰计不得低于2 000。

表1 流动相梯度洗脱程序（%）Tab.1 Program of gradient elution of mobile phase（%）

2.2.2 溶液制备

取长梗冬青苷对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每1 mL含0.3 µg的对照品溶液。取样品适量，研细，取1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率为300 W，频率为40 kHz）30 min，取出，放冷，再次称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得试品溶液。按解热颗粒处方和制备工艺制备缺四季青的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制备缺四季青的阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别吸取2.2.2项下3种溶液各适量，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果阴性对照品溶液色谱图中，在与长梗冬青苷对照品溶液相同保留时间处无干扰峰，表明方法专属性良好。色谱图见图2。

1.长梗冬青苷A.供试品溶液B，B'.对照品溶液（进样量分别为10 µL和20 µL）C.阴性对照品溶液图2高效液相色谱图1.PedunculosideA.Test solution B，B'.Reference solution（injection volumes of 10 µL and 20 µL，respectively）C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms

线性关系考察：分别精密量取2.2.2项下长梗冬青苷对照品溶液4，8，12，16，20µL，按2.2.1项下色谱条件进样测定，以长梗冬青苷对照品进样量（X，µL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程logY=1.582 7 logX+2.149 4（r=0.999 7，n=5）。结果表明，长梗冬青苷的进样量在0.715 4～3.557 5 µg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2.2项下长梗冬青苷对照品溶液适量，按2.2.1项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果长梗冬青苷平均峰面积为337.40，RSD为1.40%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取2.2.2项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0，12，24，48 h时按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果放置0，12，24，48 h时长梗冬青苷的含量分别为0.901 1%，0.913 2%，0.919 5%，0.905 2%，放置12，24，48 h时的RSD分别为0.90%，1.40%，0.30%，表明供试品溶液在室温放置48 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（批号为201001）样品适量，精密称定，共6份，依法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果样品中长梗冬青苷的平均含量为9.01 mg/g，RSD为1.40%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批（批号为201001）样品适量，精密称定，共6份，精密加入质量浓度为0.181 1 mg/mL的长梗冬青苷对照品溶液15 mL，挥干溶剂，依法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.2.4 样品含量测定

取3批（批号分别为201001，201002，201003）样品各适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1项下色谱条件进样测定2次，记录峰面积，并计算样品含量。结果3批样品中长梗冬青苷的含量分别为7.90，7.60，7.40 mg/g。

3 讨论

3.1 TLC鉴别

本研究中参考2020年版《中国药典（四部）》［4］和文献［1-3］，采用TLC法对制剂中大青叶和四季青进行定性鉴别，分别选用有效成分靛蓝和靛玉红、长梗冬青苷作为对照。结果显示，大青叶和四季青的TLC分离效果较好，斑点显色清晰，可有效进行鉴别。同时，参考文献［6-8］对方中鸭跖草、荆芥和紫苏叶进行了TLC鉴别，发现这3味中药材的分离效果较差，且斑点不清晰，故暂未列入质量标准，有待进一步研究。

3.2 含量测定

长梗冬青苷是四季青的主要有效成分，属五环三萜类化合物［9］，是四季青的指标性成分［4］。本研究中建立了测定解热颗粒中长梗冬青苷含量的HPLC法，并进行了方法学考察。结果显示，长梗冬青苷色谱峰的峰形良好，且分离度佳，各组分互不干扰，表明含量测定方法简便，结果可靠。同时，对方中君药鸭跖草和臣药大青叶也进行了含量测定，结果发现峰形不佳，且分离效果较差，故暂未列入质量标准，有待进一步研究。