探索性医学细胞生物学实验设计与实践

高芙蓉，李 姣，许 洁，贾 松，徐 磊，吕立夏

（同济大学医学院，上海 200092）

0 引言

细胞生物学是一门以实验为基础的技术性和实践性很强的学科。细胞生物学实验课的开展不仅有助于学生更好地理解和把握细胞生物学理论知识、掌握研究细胞的基本方法和实验技能、培养学生的科研能力，而且有助于高素质、创新能力强的生命科学人才的培养，为其将来从事工作奠定良好的理论和技术基础［1-2］。

随着学科前沿研究工作的突飞猛进以及国家创新型人才培养质量要求，细胞生物学实验内容需要从经典的验证性实验转向学科研究所需要的实验技能及科研素养的综合性、探索性实验转变。因此，如何将科研思维、细胞生物学技术与细胞生物学知识全面融合，提高学生的实验积极性和对知识的综合应用能力，培养学生的科研创新能力，是各大高校在教学中不断进行探索的问题［3-7］。

针对我校目前细胞生物学实验的现状，教学团队对实验教学内容进行了更新、优化，删除验证性的光学显微镜的使用、细胞融合等实验，保持原有干细胞培养及诱导分化［8］的优势，引入2020 全球临床医学领域TOP10 研究热点中之一——肿瘤，以临床现实问题为出发点，设计综合性、探究性的肿瘤细胞生物学实验，体现分子-细胞器-细胞3 个层面的研究，引导学生将理论知识融会贯通，并应用于对实际问题解决的探索和研究中，充分发挥学生的主观能动性，提高教学效果。在教学模式上，采用临床问题导入法和线上线下混合式教学的形式，督促学生深入理解实验技术的原理，并掌握不同实验技术的应用范围，以及科学研究与人类健康、临床疾病治疗的关系，鼓励学生探究、模拟科研过程以推动学生综合运用知识和科研创新思维的培养。

1 实验的设计与实施

1.1 实验设计

癌症是世界上导致人类死亡的主要原因之一，并产生严重的经济负担。随着人口老龄化加剧、环境恶化以及其他不良习惯的出现，癌症越来越常见。世界卫生组织发布的GLOBOCAN2018 报告显示，2018 年全球有1 810万新发癌症病例，960 万癌症死亡病例，其中我国有428.5 万新发病例和286.5 万癌症死亡病例［9-10］。尽管科技不断进步提高了癌症患者的生存率，但晚期癌症依然是非常难治的疾病［11］。针对肿瘤细胞特有的生物学特征，比如无限增殖、具有迁移和侵袭能力等的实验设计可以激发学生的学习兴趣和积极性，建立基础医学与临床医学之间的联系。宫颈癌是女性第4 大常见癌症，高危人类乳头状瘤病毒（HPV）的持续性感染是子宫颈癌的主要危险因素，其中HPV16 和HPV18 约占所有宫颈癌病例的90%。感染这两种高危型的女性比感染低风险HPV 型的女性更有可能发展为侵袭性癌症［12］。不管低危还是高危型，所有HPV均感染上皮细胞并使其永生［13］。上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）是细胞失去其上皮特征（细胞连接）而获得间充质特性（运动性增强等）的过程。EMT 赋予癌细胞转移（迁移、侵袭）特性，而转移是宫颈癌患者的最常见的死亡原因［14］。鉴于EMT在肿瘤进展、转移和耐药性中的重要作用，EMT 可作为一些癌症的预后指标和治疗靶点［15］。因此本教学团队以不同HPV感染的子宫颈癌细胞系SiHa（HPV16）、Hela（HPV18）、C33A（HPV 阴性）、Ca Ski（HPV16，18 共感染）和对照细胞系人宫颈永生化鳞状细胞Ect1／E6E7 为实验材料，提供多种与EMT 相关的小分子抑制剂如TGF-b 通路抑制剂RepSox等，以细胞培养为基础，开展细胞增殖、细胞周期、细胞运动等实验技术的训练和科学创新思维和能力的培养（见图1）。实验内容包括细胞复苏、传代培养、细胞铺板、细胞增殖检测（Edu 染色法）、细胞周期检测（PI染色法+流式）、细胞迁移实验（划痕法）、细胞侵袭实验（transwell 小室法）和免疫荧光共8 个实验。其中前3 个实验必做，保证学生学会细胞培养基本操作，后5 个实验由学生自主选做。学生根据课前文献查阅和小组讨论选择想要研究的细胞模型、抑制剂，设计实验方案，研究不同抑制剂对不同HPV 感染的子宫颈癌细胞增殖、迁移的影响。实验授课分小组开展，每组4 人，由1 位老师带教，授课2 次，每次6学时。

图1 肿瘤细胞生物学实验设计

1.2 实验实施过程

本研究于2020 年秋季学期在口腔专业二年级56名学生的生命科学综合实验中进行。开课前告知学生实验改革目的、验证性实验和探索性实验的异同，以及后续实验数据的收集和分析，获得了学生的知情同意。本着以学生为本的原则，通过问卷星平台由学生自主选择参加对照班（原有的光学显微镜的使用和细胞融合实验）或实验班（肿瘤细胞生物学实验，其余实验与对照班相同）。

（1）课前。①分组：选择实验班的学生自由组合，4人1组。②线上资源学习：提前1周将实验所涉及技术的讲解及操作视频（无菌操作、细胞复苏、传代、冻存、细胞增殖检测、肿瘤细胞迁移和侵袭功能检测、免疫荧光染色等）以及课程提供的细胞系名称和小分子发布在学银在线网络教学平台。同时，在线上讨论区提出临床现实问题（肿瘤的发生率、死亡率；肿瘤的类型；不同基因突变造成的肿瘤（比如宫颈癌）的治疗方案的选择；肿瘤发生及转移背后的细胞分子机制等；肿瘤（如子宫颈癌）的预防和治疗），由学生查阅文献、在讨论区互相讨论，根据视频所学设计实验，并以小组写出实验原理、实验材料和实验步骤，老师确认实验方案。

（2）课中。以肿瘤细胞增殖和迁移检测为例的实验具体安排如表1 所示。①第1 次课：肿瘤细胞生物学I。实验内容包括细胞复苏、传代、铺板（用于第2次课增殖和迁移实验），或细胞爬片（用于第2 次课细胞骨架分布检测）等。实验室为学生准备5 种细胞系，1 株人宫颈对照细胞系，4 株人宫颈癌细胞系。每组学生根据课前文献查阅和小组讨论选择适当细胞系进行复苏。用不同的细胞系可以提高学生的兴趣，增加学生的主观能动性。第2 天中午换液；第4 天进行细胞消化、计数、铺板、传代；第5 天确定对照组和实验组，在实验组中加入小分子。②第2 次课：肿瘤细胞生物学II。以学生检测肿瘤细胞的增殖和迁移为例。课前1 天：在自己小组铺好的细胞板上利用枪头划出十字型痕迹（用于第2 天迁移实验检测），用PBS（磷酸缓冲盐溶液）清洗两次，加入无血清培养基及小分子药物，拍照记录。课程当天，显微镜观察不同细胞划痕边缘相对距离（即迁移能力）；在另一块细胞板上加入5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（Edu），2 h 后，荧光显微镜观察对照组和实验组中细胞的增殖。

表1 肿瘤细胞生物学实验安排（以肿瘤细胞增殖和迁移检测为例）

在每次课之间的时间，实验室开放供学生前来进行细胞观察、换液等操作。

（3）课后。①结果分析与讨论，每组学生对实验结果、实验过程中遇到的问题进行分析讨论，找出实验成功或失败的原因。②每组学生撰写实验报告，内容包括实验原理、实验结果，对实验结果进行合理的分析并得出结论，对实验中遇到的难点、疑点进行归纳、整理、分析和总结。

2 实验效果评价的指标

采用3 个指标——学生实验结果；实验前后学生对实验的主观感受；期末考试成绩来评价实验改革的效果。

2.1 学生实验结果

获得阳性实验结果、达成教学目标是本实验项目重要判断原则。本实验的教学目的是要求学生通过实验掌握基本的细胞培养技术包括细胞复苏、细胞计数和细胞传代培养，同时能熟悉肿瘤研究常用的实验技术原理及操作，包括细胞增殖、细胞迁移、细胞侵袭、免疫荧光染色等实验，并能融会贯通所学理论知识（细胞骨架、细胞运动、细胞连接、细胞增殖与周期），分析实验结果，获得实验结论。

2.2 学生主观感受评价

通过问卷星向学生发布两份调查问卷，1 份在课前课后针对所有学生发放，问卷问题针对实验效果、实验内容和实验方式。第2 份调查问卷仅向实验班同学发放，问题针对肿瘤细胞生物学实验，包括13 个封闭性问题，从三个维度进行评估：学习效果（8 个问题，如“实验具有挑战性”“提高相关知识点的理解”）；实验满意度（3 个问题，如“实验内容及信息量合适”）；团队表现（2 个问题，如“所有团队成员都努力参与实验相关事宜”）以及1 个开放性问题，要求学生列出2 个最能描述他们对实验的形容词。所有封闭式问题的回答都使用Likert scale5 分量表（从非常同意＝5 到非常不同意＝1）。问卷的设计参考Thompson 及其同事设计的一份经过验证的用于衡量医学教育团队质量的问卷［16］。

2.3 期末考试成绩

比较了所有学生的期末考试成绩。考虑到学生学习能力和习惯等不同，同一种教学方式对不同学生的教学效果可能不同，因此，对平均绩点（Grade Point Average，GPA）大于等于4.5，大于等于4 且小于4.5，小于4 的学生的期末考试成绩进行单独的对照组和实验组比较（见表2）。期末考试试卷由50 道客观试题（A1 和A2 试题各占一半）和5 道案例分析题组成。A2 和案例分析题侧重考试学生对知识的综合应用能力。

2.4 统计学分析

所有统计分析均采用GraphPad Prism 6 进行。对分类资料进行卡方检验。数据用“Mean ±SEM”表示，实验组和对照组之间的统计比较采用方差分析（ANOVA）或学生t检验。P＜0.05 为有统计学差异。

3 实验效果评价的结果

3.1 学生分组结果

根据学生自主选择，本实验分为对照组和实验组。对照组有28 人，上一年度GPA 为4.257 ±0.067 72；实验组28 人，上一年度GPA为4.021 ±0.099 94。两组间GPA成绩差异及分布无统计学意义（P＞0.05）。表2 显示了56 名参与者的GPA情况。

表2 对照组与实验组学生的GPA分布情况

3.2 学生实验结果

所有学生都能成功复苏细胞、进行细胞传代，没有发生细菌等污染，获得了相应的实验结果。在迁移实验中，学生发现和对照组相比，RepSox 可抑制细胞的迁移（见图2）。通过Edu 掺入实验，发现与对照组相比，癌细胞系C33A细胞增殖更多（见图3）。

图2 细胞迁移实验

图3 细胞增殖实验

3.3 学生评价

针对所有学生的问卷调查结果显示，实验课程完成后，所有学生对所有问题的评分都较课前更为积极（见表3）。在学习效果方面，对照组和实验组在课程完成后，对肿瘤知识的了解程度都比课前有显著性提高，且实验组比对照组更高。在实验内容和实验教学方式方面，尽管对照组在课程后的评分更高，但差异均无统计学意义；而在实验组中，课后在对探索性实验、科研联系的实验内容、临床联系的实验内容和半自主性实验设计方面的评分显著增高，而在传统验证性实验、传统授课方式方面则没有显著差异。

表3 实验完成前后对照组和实验组的问卷调查结果比较

实验组学生有关“肿瘤细胞生物学”实验的封闭性问题的评价如图4 所示。整体而言，学生对本次教学改革是认可的，100%的学生非常同意或同意“实验内容及信息量合适”“能够激发学习兴趣”；88%的学生非常同意或同意“实验具有挑战性”；90%以上的学生认为本实验项目能促进其思考、提高其对相关知识点的理解、提升其综合运用知识的能力，实现知识内化，培养了其科学素养。在团队合作评价方面，88%的学生同意“所有团队成员都努力参与实验”，96%的学生同意“团队成员互相鼓励，表达自己的观点和想法”。如图5 所示，在开放性问题描述对实验直观感受时，最常用的词是“有趣”“实用”和“挑战性”等。

图4 实验组学生对有关肿瘤细胞生物学实验的评价（n ＝25）

图5 学生在回答开放性问题时的词云图

3.4 期末考试成绩分析

对照组和实验组学生的期末考试平均成绩（分别为61.85 ±2.074 和57.05 ±3.411）差异无统计学意义（P＝0.216 3）。然而，在先前课程的GPA大于等于4.5 的实验组学生的期末考试平均成绩（79.50 ±3.182）显著高于对照组学生（66.43 ± 2.240，P＝0.007 5）。但是在GPA 小于4.5 的学生中，期末考试平均成绩在两组中没有显著差异（见图6）。

图6 不同绩点学生的期末考试成绩比较（**P ＜0.01）

4 讨论

通过肿瘤细胞生物学探索性实验，使学生可以掌握多种实验技术，并提高理论课堂的教学质量。通过一个实验使学生能够掌握并将孤立的实验技术有机地整合，将多个知识点相联系，引导深度学习（deep learning），提高理论知识的学习效果。比如在改革后的肿瘤细胞生物学实验中，细胞传代涉及细胞膜、细胞粘附分子、细胞连接；细胞迁移实验涉及细胞骨架、细胞运动；细胞增殖涉及细胞核、细胞周期，通过实验可以让学生将这些知识点应用起来，实现知识内化；同时也掌握了当今科研中常用的技术与设备使用，包括细胞培养、细胞增殖检测、流式细胞仪检测细胞周期、荧光染色等实验技术和流式细胞仪、荧光显微镜的原理和使用等。此外，通过该实验也强化了大健康理念。

学生实验结果显示100%的学生培养出了无污染的细胞，说明学生掌握了无菌操作技术；同时，学生设置对照组研究小分子对肿瘤细胞迁移的影响、不同细胞增殖能力等，通过对实验结果的分析，得出小分子抑制肿瘤细胞迁移的结论，相对于对照细胞系，肿瘤细胞具有更强的增殖能力等，初步培养了学生的科研能力。

肿瘤细胞生物学探索性实验是以临床实际问题出发，建立基础医学与临床医学之间的联系，增加学生的学习兴趣，使学生学有所用，增加其医生的职业使命感，提高学生利用基础医学知识解决临床问题的能力。通过小组形式由学生半自主设计实施实验，充分发挥主观能动性，提高学生对实验课的学习兴趣；小组成员之间相互讨论、合作、学习、监督完成整个实验活动，增进学生之间的交流与合作，有助于学生深刻理解实验原理和操作步骤，发现新问题，解决新问题，提高学生实验积极性，培养他们的探索精神，进而培养学生的创新思维及科研能力，为开展后续的科研项目和毕业论文设计奠定基础。与对照组学生相比，实验班学生对实验评价更为积极。学生问卷调查结果显示，整体而言，学生对肿瘤细胞生物学探索性实验是认可的，认为该实验项目能激发其学习兴趣，促进思考，提高对相关知识点的理解。词云图也显示，实验组学生认为该实验有趣、具有探索性。然而，客观的期末考试成绩，两组学生并无显著性差别，进一步分析发现，绩点大于4.5 的学生中，实验组成绩显著高于对照组，而小于4.5 的学生之间没有差异，提示探索性实验对学习成绩较好的学生益处更大，可能与优秀学生本身更多的参与实验的设计和思考有关。

与大多数研究采用随机分组的研究方式不同，本研究希望能真正发挥学生的主动性去进行学习，因此采用学生自主选择是否参与的方式决定了实验组和对照组。结果显示，只有一半人想参加探索性实验，提示对今后的教学是否应该多提供一些实验条件，供学生选择？尽管两组学生绩点没有统计学上的显著性差异，且实验组平均绩点略低于对照组，是否意味着成绩好的学生相对更保守？有意思的是，期末考试平均成绩提示本探索性实验特别有利于学习成绩较好的学生，这可能是因为优秀学生更容易成为小组指挥者，更多的探索性实验也许可以让小组学生轮流成为指挥者，充分发挥探索性实验对学生的能力培养。

5 结语

本探索性实验以临床现实问题出发，将肿瘤细胞生物学特性纳入实验教学中，使学生产生研究兴趣；设计半自主性探索性实验，与理论课内容匹配，体现出分子-细胞器-细胞3 个层面的研究，引导学生对所学知识进行融会贯通，理论与实践相结合，提高学生的科研创新思维和综合实验能力。学生实验结果和主观评价表明，该实验设计是可行的、有吸引力的、创新性的实验，对于培养学生的科研思维、促进知识内化、提高学生的实验能力具有显著的作用。