蜂蜜中甘油残留量测定及限度标准建议

李樱红 周 萍 李加芬 吴晓群 郇敏 李珊珊 胡福良

（1 浙江省食品药品检验研究院 NMPA微生物检测与预警重点实验室 浙江省药品接触材料质量控制研究重点实验室，杭州 310052；2 杭州碧于天保健品有限公司，桐庐 311500；3 安徽蜜之源食品集团有限公司，芜湖 241000；4 桐庐县市场监管局，桐庐 3 115005；5 桐庐县农业农村局，桐庐 311500；6 浙江大学动物科学学院，杭州 310058）

1 引言

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质[1]。蜂蜜在生产过程中，由于追求产量和操作不规范等因素，导致市场上会有一些非成熟蜜的出现。非成熟蜂蜜的特点是水分含量较高，约24%～36%，如果保存和生产方式不当，这种蜂蜜极易发酵，从而影响蜂蜜品质[2]。而成熟蜂蜜则是蜜蜂采集花蜜后在蜂房内自然酿造而成，水分含量在15%～20%之间，成熟蜂蜜贮存在蜂房中，蜜蜂在其上方泌蜡封盖，其质量稳定，不易发酵，市场上常见的巢蜜是成熟蜂蜜的一种商品形式[3]。当蜂蜜被微生物特别是嗜渗酵母等污染时，在高糖环境胁迫下，会分泌出甘油[4]。刘功良等[5]从蜂蜜中获得1 株可耐受700g/L 葡萄糖浓度的蜂蜜接合酵母LGL-1，这种酵母在高糖培养基中72h 后，甘油含量可达2.6g/L。Huidobro 等研究表明，在甘油含量超过200mg/kg 时，超过79%的蜂蜜中含有微生物和孢子[6]。由于非成熟蜜极易受微生物污染发酵，检测表明，其中的甘油含量明显高于成熟蜂蜜[4]。可见，甘油残留量可作为蜂蜜微生物污染时的标志性成分之一。

德国《食品化工》杂志在1998 年报道了我国蜂蜜含有大量的酵母菌和甘油，水分在20%～28%之间，8 种蜂蜜的甘油含量在500 mg/kg 以上[7]。自此甘油含量成为出口蜂蜜的必检指标。现行蜂蜜食品安全国家标准《蜂蜜》（GB 14963-2011）[1]中规定糖类和微生物等指标，受到微生物污染的蜂蜜可通过灭菌、浓缩等手段达到国家标准的要求。我国蜂蜜的行标《蜂蜜》（GH/T 18796-2012）[8]和国际食品法典委员会的蜂蜜标准《蜂蜜》（CXS 12-1981，2019 版）[9]，规定淀粉酶值和羟甲基糠醛指标，用来反映蜂蜜新鲜度，而成熟蜂蜜与非成熟蜂蜜均能达到标准要求。但是，蜂蜜因微生物污染而形成的甘油极难从蜂蜜中去除，甘油含量的高低可以真实反映蜂蜜曾受微生物污染的程度，是衡量蜂蜜品质的极为关键指标，也可以作为判定蜂蜜是否成熟的重要指标。

本文就蜂蜜中的甘油残留量进行测定，比较蜂蜜原料、不同加工方式的蜂蜜半成品和成品，以及市售商品化蜂蜜中甘油残留量，同时检测果葡糖浆中甘油残留量，根据蜂蜜及果葡糖浆中甘油残留量，提出蜂蜜中残留量限度标准的建议，进而为蜂蜜的质量控制提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 仪器与试剂

Shimadzu LC-10A 型高效液相色谱仪（包括在线脱气机、二元泵、手动进样器、柱温箱、示差折光检测器）；Sartorius BS224S 分析天平；甘油（纯度大于99%，中国食品药品检定研究院）；医药级微粉硅胶（纯度大于99%）；赤藓糖醇内标（纯度大于99%）；95%乙醇为分析纯；乙腈为HPLC 级；蒸馏水（符合GB/T 6682 一级水）。

蜂蜜原料、半成品及成品由安徽蜜之源食品集团有限公司提供，24 个商品化蜂蜜为市场采购，涉及11 家生产企业。详情见表1。

表1 市场采购商品化蜂蜜信息表

2.2 高效液相色谱法检测甘油含量

蜂蜜样品中的甘油含量检测参照《蜂蜜中甘油含量测定——高效液相色谱法》（GH/T 1313-2020）[10]。

2.2.1 样品处理

称取蜂蜜样品5.0 g，精确至0.05g，于90mm蒸发皿中，分别加入100mg/mL 赤藓糖醇内标溶液200μL，水1mL，乙醇5mL，搅拌均匀至完全溶解，加入2.5g 微粉硅胶，搅拌充分分散，150℃电热板上缓缓边搅拌边蒸干，转入50 mL 玻璃离心瓶中，加入20mL 乙腈，混匀，超声20min，每隔5min 取出摇匀，4000rpm 离心3min，吸取上清液于50mL 茄形瓶中，残渣中再加入20mL 乙腈重复提取1 次，合并上清液，70℃下旋转蒸发至干，加1mL 乙腈水溶液（9+1），超声溶解残渣，吸取溶解后的样液经0.22μm 滤膜过滤，得试样溶液。

2.2.2 空白基质标准曲线制备

称取5 份空白样品各5.0g，精确至0.05g，于90mm 蒸发皿中，各加入100mg/mL 赤藓糖醇内标溶液200μL，各加入2mg/mL 甘油工作标准液Ⅱ125μL、250μL、500μL，和20mg/mL 甘油工作标准液Ⅰ 125μL、250μL，从2.2.1“水1mL”起依此操作，得到空白基质标准曲线工作溶液。相当于标准溶液系列浓度为250mg/L、500mg/ L、1000mg/L、2500mg/L、5000mg/L。

2.2.3 液相条件

色谱柱：聚合物氨基填料色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；或等效色谱柱；流动相：乙腈+水=87+13；流动相流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测池温度：35℃；进样量：40μL。

2.2.4 测定

用空白基质标准曲线工作溶液（2.2.2）、试样溶液（2.2.1）分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以甘油与内标峰面积比值为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量。标准工作溶液及试样溶液中甘油与人标的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。

2.3 数据统计

采用Microsoft Excel 2010 对数据进行处理。

3 结果与讨论

3.1 标准曲线绘制

按GH/T 1313-2020 的要求，绘制标准工作曲线，线性方程：y=0.000810x+0.00768，相关系数r2=0.9995。空白样品及阳性样品色谱图见图1。如图1 所示，甘油和内标色谱峰分离度良好，甘油的参考保留时间为6.5 min，内标的参考保留时间为9.2 min。

图1 蜂蜜空白样品及阳性样品色谱图

3.2 蜂蜜原料中甘油残留量分析

花蜜被蜜蜂采回并贮存在蜂房中，由于蜂房环境相对洁净，蜂蜜中含有抗菌成分，水分不断蒸发，则蜂房中的蜂蜜不宜发酵。当蜂蜜被蜂农采收，蜂蜜被置于较差的卫生环境中，受到水、空气、包装桶等的污染，在常温条件下，蜂蜜产生发酵现象。作为发酵产物的乙醇、甘油、二氧化碳，在蜂蜜加工的真空浓缩工序中，除甘油以外均可被蒸发去除，因此，用甘油来指证蜂蜜的发酵事实是一种行之有效的方法[4]。通过对常见的油菜蜂蜜、洋槐蜂蜜、椴树蜂蜜、荆条蜂蜜、枣花蜂蜜、荔枝蜂蜜等原料以及封盖的成熟蜜（巢蜜）进行甘油残留量分析，结果见表2。

表2 蜂蜜原料中甘油含量

从表2 可知，蜂蜜原料样品中的水分含量范围为16.3%～29.2%，蜂蜜原料均检出了甘油，含量范围为28.2～478mg/kg。研究发现蜂蜜原料的水分含量在18%以下时，相应的甘油残留量在50 mg/kg 以下。水分含量在18%～23%时，甘油含量在28～100mg/kg 之间。当水分含量超过23%时，甘油含量在103～478mg/kg之间。表明蜂蜜原料中水分含量越高，甘油含量也越高。这与前人研究结果[11,12]一致：蜂蜜含水量在17.1%～18%时，每克含1000 个以下菌体的蜂蜜，一般条件下贮存1 年之内不会发酵，蜂蜜水分超过20%时，发酵很容易发生。这同样说明了蜂蜜采收时，应充分保证卫生规范的重要性。

3.3 蜂蜜半成品中甘油残留量分析

对常见的油菜蜂蜜、洋槐蜂蜜、椴树蜂蜜、荆条蜂蜜、枣花蜂蜜、荔枝蜂蜜等蜂蜜半成品进行甘油含量的分析，结果见表3。

从表3 可知，蜂蜜原料贮存近1 个月后，浓缩加工成的半成品蜂蜜中，水分含量范围为18.2%～19.3%，而甘油含量明显升高，最高达到895mg/kg。值得注意的是，有2 批来自我国西北的洋槐蜂蜜的甘油含量提升不明显（收购日期20210505和20210512），仍然在100mg/kg 以下，可能是由于西北地区干燥多风，洋槐蜂蜜容易脱水，且环境微生物污染程度低，不易产生发酵。蜂蜜原料到工厂后，等待抽样检测的时间较长，等到全部检测结果出来做出品质判定时，至少需要半个月的时间，加上时值春季，气温升高，微生物很易繁殖。李亮等报道[13]，蜂蜜在室温下贮存第4 周时，蜂蜜中甘油含量明显增加，从649mg/kg 增加到1101mg/kg。因此，为了保证产品质量，到工厂的蜂蜜应该尽快进行浓缩。建议工厂可对高风险且关键的质量安全项目进行检测，符合要求即可进行浓缩。

表3 蜂蜜半成品中甘油含量

3.4 蜂蜜成品中甘油残留量分析

对3.3 的半成品蜂蜜进行成品加工，取样分析甘油残留量，结果见表4。

从表4 可知，经过浓缩后，蜂蜜的水分范围降到16.3%～19.5%，甘油含量范围为 30.8～890mg/kg。表明蜂蜜处于品质稳定的状态，不容易产生发酵现象，其甘油含量变化幅度不大，达到相对稳定的状态。

表4 蜂蜜成品中甘油含量

3.5 商品蜂蜜中甘油残留量分析

从原料、半成品、成品的检测情况看，甘油含量在水分低于19.5%以下时稳定，当水分高于24%时，蜂蜜处于发酵活跃状态，甘油含量处于快速增加期。在生产过程中，工厂对蜂蜜进行了灭菌处理，水分也降到19.5%以下的水平，此时，蜂蜜中甘油含量变化率在-9.43%～8.81%之间，处于相对稳定期。

对市售的24 个商品化蜂蜜进行甘油检测，结果见表5。

表5 商品蜂蜜中甘油含量

从表5 可知，市售商品化蜂蜜均检测出甘油残留。4 个蜂蜜样品甘油残留量小于100mg/kg，3 个蜂蜜样品甘油残留量为100～199mg/kg，6 个蜂蜜样品甘油残留量为200～399mg/kg，2 个蜂蜜样品甘油残留量为400～800mg/kg，3 个蜂蜜样品甘油残留量为800～999mg/kg，6 个蜂蜜样品甘油残留量大于1000mg/kg，占比25%。甘油含量小于400mg/kg 的蜂蜜占比54.2%，表明由于我国蜂蜜国家或者行业标准未规定甘油出限量质量指标，生产企业未对蜂蜜中甘油含量进行监控，原料未及时采取冷藏或者及时加工等防止微生物发酵的措施，导致市场上不同品牌不同花种蜂蜜中甘油含量差异较大的现象发生。

3.6 蜂蜜中甘油含量的限量标准现状分析

甘油被认为是区别成熟与非成熟蜂蜜的主要指标，常常出现在出口蜂蜜的质量指标中。一些国内企业对蜂蜜中甘油的限量做出了规定，我国现行蜂蜜质量标准如下表6，作为蜂蜜发酵程度及蜂蜜成熟度的指标，甘油是蜂蜜质量指标的关键项目。某企业对甘油限量给出小于100mg/kg 的要求，从我们抽查的商品蜂蜜情况看，只占到总数的17%，按团体标准300mg/kg 的限量要求，只占到总数的29.2%。我国市场上蜂蜜中甘油的含量处于一个较高水平，大部分不能达到团体标准特等品的要求。消费者报道栏目对市场上的8 款蜂蜜进行了甘油含量检测[14]，仅1 款小于300mg/kg，500mg/kg 以下的有4 款，占50%。甘油含量大于1000mg/kg 的有2 款蜂蜜，或已变酸。

表6 现行不同蜂蜜质量标准质量指标比较

3.7 蜂蜜中甘油含量的限度标准建议

蜂蜜中的甘油含量与酵母菌发酵直接相关，发酵程度又与蜂蜜污染微生物的程度以及含水量有关。从原料情况看，蜂蜜送到工厂时，就可能有甘油的存在，当蜂蜜中水分低于24%时，甘油含量处于一个较低水平，蜂蜜含水量在20%以下时，蜂蜜中的甘油含量处于稳定。

本文检测了24 个商品化蜂蜜样品，结果300mg/kg以下占比29.2%，500mg/kg 以下占比54.2%。前期研究报道表明，316 个蜂蜜样品中，300mg/kg 以下占比67%，500mg/kg 以下占比87%[6]。在8 个蜂蜜样品中，300mg/kg 以下占比12.5%，500mg/kg 以下占比50%[13]。

综合上述情况，建议甘油残留量300mg/kg 以下的蜂蜜为特等品，甘油残留量在300～500mg/kg 的蜂蜜为合格品（按蜂蜜团体标准的分级方法）。成熟蜂蜜甘油含量应控制在200mg/kg 以下。

4 结论

通过前期研究，起草发布了行业标准《蜂蜜中甘油含量测定——高效液相色谱法》（GH/T 1313-2020）[10]，将甘油列为蜂蜜品质指标，可以监控蜂蜜的微生物污染状况，促使蜂农生产成熟蜂蜜，提升蜂农采收蜂蜜的卫生意识，从而提升我国蜂蜜的整体质量水平[15]。本研究进一步检测了原料、半成品、成品蜂蜜、商品化蜂蜜中的甘油残留量，查阅了相关文献，建议甘油含量300mg/kg 以下的蜂蜜为特等品，甘油含量在300～500mg/kg 的蜂蜜为合格品（按蜂蜜团体标准的分级方法）。成熟蜂蜜甘油含量应控制在200mg/kg 以下。根据蜂蜜中甘油形成的原理，建议蜂农在取蜜时，应注意卫生，防止微生物的污染，提倡生产成熟蜂蜜。蜂蜜原料到工厂后，应将蜂蜜置于阴凉、通风、干燥处，并尽快将蜂蜜浓缩至水分20% 以下。蜂蜜加工应注意控制微生物指标，对于微生物超过国家标准的蜂蜜，应做好灭菌工作。