植物多酚共价修饰在降低蜂花粉致敏性中的潜在应用研究进展

周恩宁 李强强 吴黎明

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093）

1 蜂花粉营养成分及其生物活性

蜂花粉是指蜜蜂从植物花药中收集花粉，将其与少量唾腺分泌物或花蜜混合而成的不规则团状物[1]。研究表明，蜂花粉中含有约200 多种营养物质与活性成分，具有延缓衰老、增强机体免疫力、抑制前列腺疾病等功效，是理想的功能性食品。其组分主要包括碳水化合物、蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质、植物多酚类化合物等（如图1 所示）。其中，蜂花粉中的碳水化合物由单糖、双糖及多糖组分构成，约占总干重的2/3[2]。它们在生物功能的调节中具有重要作用，具有防止肥胖、改善肠道环境、抗癌、抗肿瘤的功效。例如，碱提红花蜂花粉多糖组分（APBPC-3）及云南产红花蜂花粉多糖组分（APBPC-2）对前列腺癌细胞DU145、人乳腺癌细胞MDA-MB231 和人肝癌细胞HepG-2 的增殖具有抑制作用[3]；荞麦蜂花粉水溶性多糖（WFPP）对抗生素诱导的微生物菌群失调具有缓解作用等[4]。蜂花粉中蛋白质的含量（一般为7.5%～35%）仅次于碳水化合物，其中包含20 多种游离氨基酸，且其必需氨基酸的含量比鸡蛋、牛肉等高3～5 倍，具有很高的膳食利用价值。脂类是蜂花粉中的第三大营养成分，它包含脂肪、磷脂等，其中多不饱和脂肪酸种类丰富，对于促进大脑发育、提高记忆力以及预防动脉粥样硬化具有良好功效。植物多酚类化合物在蜂花粉中的平均含量在1.6%左右，主要包括酚酸和黄酮类化合物等[5]，它们可通过调节酶活性和信号转导、清除自由基、螯合金属离子以及激活转录因子和基因表达等发挥抗肿瘤、抗衰老、抗炎、抗糖尿病、抗癌等多种生物活性功能[6]。蜂花粉提取物中含有的酚酸类和黄酮类化合物具有清除自由基和降低血糖的潜力，并通过研究证明蜂花粉水乙醇提取物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用，可减缓双糖的分解，减少血液中的糖累积[7,8]。

图1 蜂花粉中各成分占比及蜂花粉过敏原引发的食物过敏

2 蜂花粉致敏及脱敏研究现状

尽管蜂花粉中一些过敏原会因蜜蜂加工而部分降解或减少，但这仍不能避免因食用蜂花粉或蜂花粉制剂而引发的食物过敏。而且随着蜂花粉在食品、化妆品和保健品中的推广，蜂花粉致敏问题不容小觑，因此与蜂花粉过敏原相关的潜在问题亟待解决。

蜂花粉引起的食物源性过敏反应大多属于IgE 介导的速发型过敏反应。总的来说，当机体初次受到过敏原刺激时会产生特异性抗体IgE，IgE 与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力受体（FcɛRI）结合而使机体处于致敏状态。当机体再次暴露于相同的过敏原时，过敏原将与致敏肥大细胞/嗜碱性粒细胞表面的IgE 抗体特异性结合，使之脱颗粒，释放出组胺、5-羟色胺、白三烯及嗜酸性粒细胞趋化因子等大量致敏介质，作用于效应组织和器官而引起局部或全身过敏反应，导致机体出现腹泻、荨麻疹、喉水肿、呼吸急促等异常现象[9-11]。在前期研究中，分别通过发酵及酶解的方式对油菜蜂花粉蛋白进行处理，并通过基于质谱的蛋白质组学鉴定出其中几种潜在的致敏原。而且两种处理方式的代谢组学分析显示，经过发酵和酶解处理后，其中潜在的致敏原含量均明显降低，而且经过体外免疫评估也发现，油菜蜂花粉蛋白与特异性IgE 的结合能力显著下降[12,13]，这为脱敏蜂花粉产品开发提供了启示。

3 植物膳食多酚的功效

膳食多酚是指植物中存在的具有多个羟基取代基或基团的天然芳香环化合物，是具有多酚结构的非能量次级代谢物[14]。根据化学结构，膳食多酚可以分为黄酮类化合物，如黄酮、黄酮醇、查耳酮、花色素和原花色素等，以及非黄酮类化合物，如酚酸、芪类化合物和酚酰胺等[15]。目前，植物多酚已被证明具有减轻炎症、预防糖尿病、下调促炎细胞因子等免疫调节作用[16]。如绿茶多酚可以降低高脂饮食诱导的肥胖犬的体重增加，改善其肠道微生物群的变化并减轻肠道炎症[17]；芒果多酚、石榴多酚可以下调促炎细胞因子，改善炎症性肠病[18]；槲皮素能够抑制胰腺铁沉积，改善II 型糖尿病[19]；以及丁烯酸、小构树多酚能够预防细胞因子诱导的胰岛B 细胞损伤和减少/延迟I 型糖尿病中胰岛B 细胞损伤的程度等[20,21]。

膳食多酚在抗过敏方面也具有良好功效。有研究表明，多酚可以通过抑制过敏小鼠外周B 细胞的粘附和迁移、抑制IgE 和IgG1 水平以及消除Th2 型细胞因子来减轻过敏反应[22]。黄酮类化合物可以通过抑制MHC-II 和共刺激分子（CD80、CD86）的细胞表面表达，导致抗原呈递无效或抑制细胞因子的产生，直接影响树突状细胞的抗原呈递[23]。酚类化合物，如咖啡酸和阿魏酸，已被证明可降低花生提取物和液体花生酱的过敏性，与过敏蛋白形成不溶性复合物[24]。因此，膳食多酚在脱敏/降敏方面的应用值得进一步研究。

4 植物多酚共价修饰致敏蛋白的研究进展

蛋白质与膳食多酚可通过非共价键如范德华力、氢键以及疏水相互作用等实现两者的非共价结合，但这样形成的复合物容易受外界因素的影响发生解离[25]；而蛋白质与植物多酚的共价结合可以形成强而稳定的共价复合物，据研究报道，酶法、碱处理法与自由基诱导法均可以制备出稳定的蛋白质-多酚共价复合物。其中，酶法是指在条件温和的环境下使用漆酶和辣根氧化酶等酶催化诱导蛋白质与多酚间的共价反应，具有安全性、广适性的优点；自由基诱导法是指过氧化氢（H2O2）与抗坏血酸发生氧化还原反应生成羟基自由基，羟基自由基再氧化蛋白质侧链上的氨基酸，最终多酚与氧化的蛋白共价结合[26,27]；碱处理法是指多酚可以在碱性（pH=9）有氧条件下氧化为醌，而醌是一种反应性亲电中间体，通过与蛋白质侧链的巯基或氨基亲核加成形成强而稳定的C-S 或C-N 键形成共价键[27]。

研究表明，膳食多酚与蛋白质共价结合可以改变蛋白质起泡性、凝胶性、乳化性、溶解度等功能性质[28]；而且，蛋白质-多酚相互作用能使蛋白具有较强的抗氧化能力和多种生物活性，例如抗溃疡、抗癌及预防心血管疾病等。除此之外，膳食多酚与致敏蛋白共价结合还可以降低食物致敏蛋白的致敏性，改善食物过敏反应。而且近年来有许多学者研究了膳食多酚和致敏蛋白共价结合，以减少/消除食物过敏原的致敏性。据报道，绿原酸（CA）和木犀草素共价修饰小麦过敏原Gliadin，使其IgE 结合能力下降，并显著提升其热稳定性、抗氧化活性及体外消化率[29]。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和CA 共价修饰β-乳球蛋白（β-LG），可以改变β-LG 的空间结构，有效降低β-LG 与IgE 的结合能力[30]。同样，EGCG 和CA 共价修饰花生变应原Ara h1 降低了其变性温度和IgE 结合能力，并使嗜碱性细胞的组胺释放显著减少。而且，经体外消化实验证明，与膳食多酚共价结合后Ara h 1 的消化率明显提高[31]。此外，EGCG 对卵清蛋白（OVA）的共价结合提高了OVA 的消化率和抗氧化能力，并降低了OVA 的IgE 结合能力。除了EGCG 和CA，槲皮素也被用于与致敏蛋白共价结合。而且，槲皮素对OVA 的共价修饰可以改变OVA 的二、三级结构，破坏或掩盖OVA 的抗原表位，降低其IgE 结合能力，并显著降低小鼠脾脏中Th2 型细胞因子IL-13、IL-4和IL-5 以及略微升高Th1 型细胞因子IFN-γ，调节Th1/Th2 免疫反应的不平衡，缓解小鼠由OVA 引起的过敏反应[32]。

因此，植物多酚共价结合致敏蛋白的潜在降敏机制可以由图2、图3 解释，即：结合致敏蛋白过敏原与膳食多酚结合可以增强蛋白聚集，改变致敏蛋白的结构性质，从而改变其变应原性，使致敏蛋白的IgE结合能力降低，并抑制Th 细胞分泌致敏细胞因子，抑制肥大细胞释放过敏介质[25,33]。说明膳食多酚共价修饰食物致敏蛋白是一种有效的食物降敏或脱敏方式，具有广泛的应用前景。

图2 植物多酚共价修饰过敏原导致过敏原构象改变

图3 植物多酚共价修饰降低过敏原变应原性的潜在机理

5 食物致敏蛋白的免疫原性评价

5.1 体外检测

5.1.1 免疫学方法

酶联免疫吸附（ELISA）能够利用连接到抗体上的酶来检测抗原-抗体复合物，并通过颜色变化来指示抗原-抗体复合物的存在，通常用于血清中的抗体和食品中的致敏原的定性或定量检测。但它不能检测受损或未折叠的致敏蛋白，因此，ELISA可以用于评估经过某种加工手段处理后的食品中致敏原构象表位是被暴露还是掩盖或破坏，从而检验食品加工技术对食品中致敏原破坏的有效性[34]。蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot 可以将电泳分离后的致敏蛋白从凝胶转移到固相载体上，然后用特异性抗体对致敏蛋白进行检测，现已广泛应用于抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面[35]。斑点印迹试验（Dot Blot）是一种利用固相载体，进行抗原、抗体反应的免疫学检测方法，相比于Western Blot 可以快速、微量的对食物中的致敏原进行评估[36]。

5.1.2 聚合链式反应（PCR）

当致敏原含量很低无法通过免疫学方法进行分析时，可以通过PCR 来检测致敏原的基因含量从而对致敏原进行评估，因为基于PCR 的方法对致敏原进行评估是对致敏原的DNA 进行检测而不是致敏蛋白[37]。而且食品加工可能会导致蛋白质聚集而使抗原表位被掩盖或破坏蛋白质的空间构象使致敏蛋白不能够被常规检测方法指示，但DNA 却能够在加工过程中更稳定[38]。因此，PCR 比基于抗体的检测方法更有效、灵敏度更高。

5.1.3 色谱-质谱联用分析

色谱-质谱联用可以对致敏蛋白进行鉴定和表征，它具有高灵敏性、高分辨率、高自动化等优点，并且可以评估经过加工处理后的食品致敏蛋白、亚型、特异性肽段等，并且在检测复杂样品中的多个过敏原蛋白时具有优越性，不依赖于免疫学方法中抗原与抗体的相互作用[39]。

5.1.4 基于生物传感器对食物过敏原检测的方法

生物传感器可以将固定化的生物活性材料作为识别元件，通过换能器将生化反应转变成可定量的物理或化学信号，在食品工业中可以用于食品病原体、食品添加剂及食品致敏原等的检测[40,41]。生物传感器具有灵敏度高、微型化等优点，近年已有多种用于检测食品中致敏原的生物传感器被开发并成为食品过敏原检测的高新技术。

5.2 体内检测

5.2.1 临床人体试验

目前临床常用的过敏原检测方法有：皮肤点刺试验（SPT）、特应性斑贴试验（APT）、皮内试验、血液试验等。SPT 指的是将过敏原引入皮下，检测与皮下肥大细胞结合的特异性IgE 抗体的产生。SPT 敏感性高，假阳性低，重现性好，对患者的不适最小，结果在15min 内得出。APT 是指将带过敏原的贴片贴在试验部位，48～72h 后检查反应。皮内试验是指皮内注射过敏原，它比SPT 更敏感，但假阳性率较高，对患者的风险较高[42]。血检通过检测血液中的抗体来检测过敏原，主要用于怀疑食物过敏，血液测试比皮肤测试更安全、更准确，但比皮肤测试更昂贵、更耗时[43]。

5.2.2 基于动物模型评估食物过敏原的免疫原性

食物过敏的动物模型是对过敏原研究更安全高效的方法。目前已知的动物模型有啮齿类动物模型：小鼠、大鼠及豚鼠模型；非啮齿类动物模型：猪、狗模型。与人类相比，猪、狗模型具有与人类相似的免疫系统，但是它们操作难度大，需要大量的蛋白质给药，敏化需要较长的给药时间，维护成本高，而且缺乏相应的免疫试剂，因此限制性比较大[44]。而啮齿类动物由于体积较小，繁殖周期短，因此对食物过敏进行评估时应用比较广泛。目前，用于评估食物过敏原的啮齿动物中，以小鼠品系应用最多，如BALB/c、C3H/HeJ、A/J、C57BL/6 及KM 小鼠等，大鼠品系有BN、SD、Wistar 等以及Hartly 豚鼠模型。它们主要作为食物过敏、皮肤过敏、过敏性哮喘等模型应用于食物过敏原的评估。

一般来说，食物过敏会使体内Th1/Th2 免疫反应失衡，使免疫反应向Th2 方向发展，此时，Th1 型细胞因子低于正常水平，而Th2 型细胞因子高于正常值。IL-2 和干扰素γ（IFN-γ）是Th1 型细胞产生的主要细胞因子，IL-2 可以刺激Th1 细胞产生IFN-γ，IFN-γ 可以阻止抗体种类向IgE 的转化并抑制Th2免疫应答。IL-4、IL-5、IL-13 是Th 2 型细胞产生的主要细胞因子，它们可以促进IgE 的转化，诱导IgG同种型转变为IgG1 并刺激肥大细胞增殖，从而诱发机体全身过敏反应[45]。Th17 细胞可以促进IgE 产生，并且IL-17A 能够直接在B 细胞水平上发挥其促过敏作用[46]。调节性T 细胞（Treg）是影响过敏反应的另一关键因素，它可以分泌抑制性细胞因子IL-10 和/或转化生长因子-β（TGF-β），从而抑制效应Th1、Th2 和Th17 细胞，抑制肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞，并消除过敏原特异性IgE 的产生[47]。肥大细胞蛋白酶-1（mMCP-1）是检测肥大细胞脱颗粒的关键指标，而且血清中的IgG、IgG1 水平与Th2 免疫水平呈正相关，故在对过敏原评估时对血清中IgG、IgG1、mMCP-1 的检测同样重要。

例如，Zhang 等人以卵清蛋白、卵清蛋白-槲皮素共价复合物分别配合霍乱毒素为佐剂口饲BALB/c 小鼠，他们发现复合物能够降低小鼠血清中IgE、IgG1、IgG、血浆组胺和mMCP-1 的水平，并显著降低小鼠脾脏中Th2 型细胞因子IL-13、IL-4 和IL-5以及略微升高Th1 型细胞因子IFN-γ，这表明复合物可以调节Th1/Th2 免疫反应的不平衡，缓解小鼠由卵清蛋白引起的过敏反应[32]。Yang 等人对BALB/c 小鼠管饲乳酸菌处理的大豆蛋白，他们发现与管饲未经过处理的大豆蛋白的小鼠相比，IFN-γ 和IL-2 和IL-10 细胞因子的分泌增加，IL-4 和IL-6 和IL-17A细胞因子的分泌减少，证明乳酸菌可以调节Th1/Th2平衡，维持小鼠免疫相关细胞和细胞因子的正常水平[45]。

6 总结与展望

综上所述，蜂花粉营养丰富，具有极高的保健价值及开发潜力。然而，蜂花粉中过敏原的存在为蜂花粉的食用安全带来威胁，制约行业发展。有效改善蜂花粉的致敏问题对进一步开发相关蜂花粉产品及提高其食用安全性至关重要。到目前为止，关于蜂花粉的致敏及脱敏/降敏机制的研究报道较少。运用合适的食品加工方式及免疫评估手段对蜂花粉致敏及脱敏/降敏机理进行深入研究对于促进行业发展是十分必要的。通过本综述，可进一步明确植物多酚共价修饰技术在改善蜂花粉致敏性中的应用前景，为后续蜂花粉脱敏/低敏产品开发提供依据。