指纹图谱技术在重楼质量控制中的应用

柯昌虎，冯协和，潘长江，李志浩

(1.湖北医药学院附属国药东风总医院，湖北 十堰 442008； 2.湖北医药学院药学院，湖北 十堰 442000)

0 引 言

重楼(Paridis Rhizoma)为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎[1]，是我国重要的药用资源，是云南白药系列药等200余种中成药的主要成分之一[2]，含有甾体皂苷、三萜、黄酮等成分[3-6]，具有抗肿瘤[4]、抗氧化[7]、抗菌[8]、抗炎[9]、抗衰老[10]等多重药理作用，对多种疾病均有疗效。重楼为多年生草本植物，资源再生缓慢，人工种植尚不能满足市场需求。大量非药典规定的重楼植物基源品种的产品充斥商品市场，不同产地、不同采收期的重楼品质差异大[11]，质量参差不齐，常规的鉴别手段难以将其区分出来。

指纹图谱是一种可以鉴别中药材真伪、评价中药质量优劣、区分物种属性和确保其一致性和稳定性的综合性分析技术[12]，具备专属性强、稳定性好、重现性高等指纹特性，可以描述出中药复杂体系的整体特征，反映出复杂组分之间的相互作用，体现出不同产地、不同采收时期、不同批次中药的共同特点和特异性，量化分析出中药多层次的宏观质量信息，在多组分定量、质量控制、活性成分筛选、指纹功效关系研究等方面的应用优势明显[13-14]，可为中药材、中成药、中药制剂等提供一种综合性和可量化的质量评价方法，并收录于2020版《中国药典》一部中。本研究就指纹图谱在重楼中的研究成果进行综述。

1 色谱指纹图谱

1.1 高效液相色谱

高效液相色谱(HPLC)兼有定性和定量作用，广泛应用于中药材质量分析及控制中，选择性好，重现性和灵敏度高，应用覆盖广，且色谱柱能够反复多次利用，已成为指纹图谱中使用较多的方法之一[15]。中药HPLC可根据不同药物成分的特点选择色谱条件，搭配不同的色谱柱和检测器，实现药材产地、优劣、真伪的区分与鉴别。

罗廷顺等[16]采用Thermo BDS Hypersil C18色谱柱，以乙腈-水为流动相，对10个来自云南各州市县重楼药材进行HPLC法分析。指纹图谱中标定出13个共有峰，指认出8、9、10和S号峰分别为重楼皂苷VII、VI、II、I，图谱相似度为0.851～0.970，表明产地不同的重楼主成分具有良好的一致性。吴钰颖等[17]采用HPLC法对产自大理的重楼进行分析，色谱柱为Thermore C18，流动相为乙腈-水，建立了10个产区的多叶重楼和11个不同产地云南重楼根茎HPLC指纹图谱，共有峰分别为14个、13个，图谱相似度分别大于0.900、0.922。多叶重楼和云南重楼的根茎图谱有11个共有峰，但相似度仅为0.057～0.225，7种主要甾体皂苷成分存在较大差异，多叶重楼中重楼皂苷I、II、VI和VII的含量低于云南重楼。袁会琼等[18]采用Agilent Zorbax-SB C18色谱柱，以乙腈-水为流动相，对10批云南重楼和10批长柱重楼进行HPLC分析，共发现15个共有峰，指认出6、7、8、9号峰分别为重楼皂苷VI、VII、II、I，且长柱重楼中上述4种有效成分的含量明显高于云南重楼，图谱相似度分别为0.905～0.998和0.905～0.986，聚类分析(CA)结合主成分分析(PCA)显示20批样品被显著地分成2类，可为其品种鉴定及质量监控提供参考。钱正明等[19]采用Welch Ultimate AQ-C18色谱柱，以水-乙腈为流动相，对10批重楼样品HPLC分析，图谱中标记出16个共有峰，相似度多小于0.900，CA和PCA结果显示10批重楼聚为3类，表明重楼药材化学成分存在差异。

1.2 超高效液相色谱

与HPLC相比，超高效液相色谱(UPLC)柱效更高，具有更强的分析效率、灵敏度及分离能力，与不同检测器联用，适合于不同类型药物复杂体系的分析鉴定，结合指纹图谱技术在中药质量评价中具有的独特优势，目前对于中药重楼的研究主要集中于甾体皂苷类成分[20-21]。

赵飞亚等[22]采用UPLC法对10种不同产地重楼进行分析，色谱柱为Luna Omega Polar C18，流动相为乙腈-水，测定了55批药材中重楼皂苷I、II、VI、VII、H和薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷的含量，并采用TOPSIS模型分析，发现重楼化学综合质量差异较大。高妍等[23]采用UPLC法对云南重楼、华重楼、伪品三者进行分析，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3，流动相为乙腈-水，在10批云南重楼图谱中标定出伪原纤细薯蓣皂苷、纤细薯蓣皂苷、薯蓣皂苷及重楼皂苷VII、H、II、I、V共8个特征峰，10批云南重楼、3批华重楼的相似度分别为0.70～0.83、0.26～0.37，7批伪品图谱相似度小于0.22，CA和PCA均能使三者得以区分。张绍山等[24]对23份云南重楼及多芽品系进行UPLC分析，色谱柱为ACQUITY UPLC®BEH C18，流动相为乙腈-水，建立了10批样品的UPLC指纹图谱，标定出8个共有峰，指认出重楼皂苷VII、H、II、I 4个特征峰，重楼(多芽品系)样品间相似度小于0.9，CA和PCA分析从整体上表明样品成分及含量具有明显差异。杨远贵[25]采用UPLC法对38批不同种重楼进行分析，色谱柱为Shim-pack XR-ODS III column，流动相为乙腈-0.05%甲酸水，定量分析出重楼皂苷I、II的含量差异，并结合PCA、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)，结果显示，大部分重楼样品的含量比(重楼皂苷II/重楼皂苷I)小于100%，6种不同重楼很好聚为两类，其中滇重楼和五指莲UPLC指纹图谱中共有峰个数分别为32个、25个，相似度分别大于0.80、0.82，对重楼进行质量评价可为寻找滇重楼种源替代产品提供参考。

1.3 薄层色谱

薄层色谱(TLC)常用于鉴别、杂质检查或含量测定，在中药的质量控制中起着重要的作用，展开速率快，分辨能力强，展开剂和展开方向可随用随换，操作简便易行。随着高效薄层色谱(HPTLC)的出现，将常量薄层色谱的灵敏度和分辨力大大提高，方法更加高效、快速、可靠，可提供色谱指纹图谱的电子图像和密度图来检测植物样品中是否存在标记化合物[26]。

洪淑华[27]采用预制硅胶G薄层板，展开剂为氯仿-甲醇-水(15∶5∶1)的下层溶液，点样量2 μL，显色剂为10%硫酸乙醇溶液，105℃加热，365 nm紫外灯和日光下检视，对9个重楼商品药材和10个自然保护区来源重楼样品进行分析并建立TLC指纹图谱，以重楼皂苷I、II为指标成分，发现来源不同的重楼样品的品质参差不齐；CA显示，9个商品药材划分为5个类群，品质与来源不相一致，品种较为混乱，10个自然保护区样品划分为4个类群，与实际情况一致。于新兰等[28]采用G薄层板，展开剂选用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(17∶40∶21∶10)10℃以下放置的下层溶液，检视后可见23个荧光条斑，经串联质谱鉴别出其中8个，分别为重楼皂苷I、II、III、V、VI、VII、D和纤细薯蓣皂苷，该方法可快速鉴别重楼药材，从整体上对药材进行质量评价。

2 光谱指纹图谱

2.1 红外光谱

红外光谱(IR)中吸收峰的位置与强度反映出化学分子结构上的差异，以此来鉴别结构，适用于固态、液态或气态样品的分析，具有测定快、特征性强、分辨率高、检测无损等特点，对于中药复杂化学成分可进行多个组分定性定量分析，成为中药质量控制方面的一种有效手段[29-30]。

吴喆[31]采用FT-IR法分别采集滇重楼、白花重楼、毛重楼、南重楼、五指莲共50份样品的红外光谱信息，发现1 653、1 156、1 082、1 021、925、851、759、572、524 cm-1等为重楼属植物的共有峰，1 535 cm-1和1 369 cm-1是毛重楼和五指莲的特征吸收峰，PLS-DA和PCA分析将5种重楼准确区分。同时对9种滇重楼不同炮制品整体化学成分变化进行对比研究，特征峰分布为3 387、2 923、1 745、1 463、1 338、1 240、1 207、1 158、1 180、1 080、1 048、1 020、988、921、895、859、833、765、708、572、529 cm-1，且图谱峰形大体相似，少数特征吸收峰数目、位置和吸收强度存在差异，表明不同炮制方法造成重楼化学成分和含量的变化。余孟杰等[32]采用FT-IR对10份七叶一枝花样品进行研究，建立IR指纹图谱，并对3 400、2 940、1 640、1 411、1 250、1 200～950、1 150、1 020、920、860、760、700 cm-1附近的吸收峰进行了归属，采用相关系数法计算相似度，以此对重楼类药材进行质量评价。郑江萍等[33]建立了19份重楼药材的IR指纹图谱，共有特征峰有3 470 cm-1、2 990 cm-1、1 670 cm-1、1 420 cm-1、1 080 cm-1、960 cm-1，根据七叶一枝花、宽叶重楼、球药隔重楼、华重楼的IR图谱的差异，可对准确区分重楼药材，实现快速鉴别的目的。裴艺霏[34]以云南省和贵州省采集的野生及栽培滇重楼的根茎、茎及叶作为研究材料，用FT-MIR、ATR-FTMIR、NIR等多种光谱技术采集指纹图谱，结合多种变量筛选方法及多来源信息融合策略，建立了单一或融合PLS-DA、SVM及RF滇重楼产地鉴别及年限鉴别模型，辅以HCA及PCA方法，系统分析不同部位、年限和产地的滇重楼品质差异，建立滇重楼光谱评价体系，为滇重楼质量评价与资源合理利用提供了理论基础。

2.2 紫外光谱

有机化合物分子结构中含有发色团、助色团等官能团，能够产生特征性吸收光谱，可以利用紫外光谱(UV)对其进行定性鉴别。紫外指纹图谱可获取稀溶液中190～400 nm的化学成分的叠加信息，利用紫外光谱分析法可以检测或测定中药中总成分的不饱和化学键和共轭体系的信息[35]，特别适用于不饱和共轭体系化合物的鉴定，从而对中药实现快速、简便、准确地鉴别分析。

张金渝等[36]采用氯仿、无水乙醇和重蒸水3种不同极性溶剂分别对重楼样品进行紫外吸收光谱检测，建立了46份滇重楼及其他重楼居群的紫外光谱指纹图谱，结果显示，滇重楼的共有峰率在36.00%～77.78%，平均共有峰率为53.25%，滇中、滇南及滇西南、滇东南、滇西北、滇东及黔西5个相同地区内滇重楼居群平均共有峰率分别为51.69%、55.23%、52.8%、54.24%、54.63%，表明地理距离近、环境相似的居群具有较高的共有峰率，居群间化学成分相似程度高。该方法能够将不同地理来源的滇重楼居群区分开来，也可以将滇重楼与其他重楼区分开来。

2.3 荧光光谱

荧光光谱能够形象地反映出含有共轭双键荧光组分的各种分子信息，适用于含有荧光组分的药物成分分析，具有灵敏度高、选择性好、测试速度快等优点，可以进行中药药性识别[37]，在药物成分分析与鉴定、药动学研究、药理与药效评价等方面广泛应用。

洪淑华[27]采用荧光光谱法对9个重楼商品药材和10个自然保护区来源重楼样品进行分析并建立了荧光光谱指纹图谱，在Ex280 nm/Em330 nm和Ex280 nm/Em640 nm附近均具有荧光峰，且重楼皂苷I、II的荧光峰出现在Ex220 nm/Em340 nm和Ex270 nm/Em400 nm附近，而不同产地的样品荧光峰等高线密集程度均不一样。商品药材均在Ex280 nm/Em330 nm、Ex280 nm/Em640 nm、Ex230 nm/Em340 nm和Ex230 nm/Em640 nm处有荧光峰，自然保护区来源的样品在Ex400 nm/Em680 nm等处有荧光峰，按其三维荧光图谱可将重楼样品分为2大类。对比荧光峰峰高发现，同一产地的样品重楼皂苷含量不尽相同，相同部位不同来源的重楼样品品质不一致，同株不同部位重楼样品，根中重楼皂苷含量高于茎叶，该方法简便可靠、简便易行、特征性强，可作为重楼质量标准研究、品质鉴定的手段。

3 生物指纹图谱

分子标记技术是以生物个体间遗传物质的差异进行标记，具备灵敏度高、重现性好、分析结果准确可靠等优点。基于分子标记技术建立的生物指纹图谱已被广泛应用于药用植物鉴定鉴别研究中，并成为中药材鉴定质量控制的重要技术[38]。

辛本华等[39]对来自四川和云南的重楼属种的遗传多态性进行RSAP标记分析，构建出8个种的DNA指纹图谱，借助系统进化树可以明确不同种的进化关系，从而为重楼的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学依据。刘胜坤等[40]对13份重楼进行ISSR标记分析，12条引物扩增出条带181条，其中多态性带174条，占比96.13%，Nei’s基因多样性指数、香农指数及遗传相似系数的范围分别为0.214～0.327、0.351～0.500、0.293～0.624，并通过聚类分析将重楼种质分为3类。周武先等[41]对13份重楼样品进行CDDP标记分析，并进行条形码编码，多态性条带73个，占比91.25%，该方法检测灵敏，可以快速鉴定重楼。Duan等[42]采用DNA条形码结合高分辨熔融分析技术，对重楼及其伪品进行了鉴别，结果表明，内部转录间隔区2(ITS2)分子区域与HRM分析相结合，可以有效鉴别9种中草药，其中包括2种重楼的正宗产地和7种常见的掺假品，DNA条形码与HRM分析相结合是一种准确、可靠、快速、经济、可靠的分析工具，有助于重楼的质量控制。

4 结语

重楼是我国常用的中药材，市场需求量大，同属植物较多，存在混淆、混用或替用现象。种质来源、生产产地及方式等诸多因素都对重楼药材的质量产生显著影响，并最终影响着药物的疗效及产品的稳定与可控，以单一指标成分难以控制重楼的真实品质，建立其科学可靠的质控体系十分必要。

基于光谱、色谱、生物等方法的指纹图谱技术，可以解开重楼成分“密码”，较为全面的反映重楼内部整体特征，对药材实现真伪鉴别、优劣考察，区分药材各个部位及检测原料与成品之间的一致性和稳定性，进而对其质量进行系统描述和评价。目前，关于重楼指纹图谱技术的研究主要集中于高效液相色谱，适用于各类药材的快速高效质量分析。近年来，生物指纹图谱的研究逐渐深入，借助分子遗传标记并应用于中药材的质量控制。但是，重楼指纹图谱与生物活性或临床疗效等相关的化学成分的关联性研究报道较少，有待于确定其完整的谱效关系，揭示药材的药效物质基础。因此，综合运用各种现代技术对重楼进行深度挖掘研究，进一步完善其质量控制和评价体系，可以更好地实现重楼药材的合理开发和科学应用。