近平滑念珠菌毒力调控和耐药机制研究进展

宁雅婷 张丽 孙天舒 徐英春

(1.中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院检验科，疑难重症及罕见病国家重点实验室，北京 100730；2.中国医学科学院北京协和医学院研究生院，北京 100730；3.侵袭性真菌病机制研究与精准诊断北京市重点实验室，北京 100730；4.中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中心实验室，北京 100730)

自1980年以来，由于免疫抑制剂、抗菌药物的广泛应用以及器官移植、基础疾病增多等原因，真菌尤其是白念珠菌成为临床住院患者感染的重要致病菌。而近十年来，非白念珠菌感染率呈显著增高趋势，甚至总分离率在部分地区已超过白念珠菌，其中近平滑念珠菌位居非白念珠菌菌血症分离率第1或第2位[1-4]。近平滑念珠菌引起的侵袭性念珠菌病在临床表现与白念珠菌相似，但两者在生物学特征方面存在显著差异。近平滑念珠菌容易在中心静脉导管等医疗植入性器械表面形成生物膜，常引起导管相关性血流感染；该菌种在肠外高糖或高脂营养供应下生长迅速，严重威胁低体重新生儿和营养不良儿童的生命健康[5]。此外，近平滑念珠菌通常定植于皮肤表面而不是黏膜，很容易通过医护人员的手在院内水平传播，目前国际已有多项研究证实近平滑念珠菌导致院内感染暴发，多发生在新生儿重症监护病房[6]。近平滑念珠菌对常见抗真菌药物的耐药率较低，但近期多地已报道唑类耐药株克隆传播造成的暴发。此外该菌种对棘白菌素敏感性天然较低[7-10]。

目前对念珠菌调控网络的认知主要来源于对白念珠菌的研究。但近平滑念珠菌具有上述特有的菌种特异性生物学特征，提示该菌种在耐药和毒力调控方面可能与白念珠菌存在差异。近年随着基因编辑技术的发展，针对近平滑念珠菌的研究逐渐展开，故本文对该物种耐药和毒力调控机制的研究现状进行综述。

1 耐药机制

1.1 唑类药物

念珠菌产生唑类耐药的最常见途径是麦角甾醇生物合成机制的改变，主要为药物靶点14-α-去甲基化酶Erg11或后期合成关键酶Erg3突变或过度表达。约80%临床分离的近平滑念珠菌唑类耐药株携带Erg11的单个或联合错义突变Y132F、K143R，这两个突变已在酿酒酵母系统中被证实可增加>16倍氟康唑的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)[9-10]。还有研究报道临床耐药株特异性携带Erg11的G458S、D421N突变，其中G458S亦存在于亚种拟平滑念珠菌耐药株中，并已通过CRISPR-Cas9系统证实可增加>16倍氟康唑MIC值，蛋白结构显示该位点接近血红素丙酸基团，可能通过影响氢键相互作用从而影响唑类结合[8,11-12]。此外，Branco等[13]发现泊沙康唑体外诱导获得的唑类近平滑耐药株在Erg3的真菌保守位点发生R135I突变，该突变将极性正电荷氨基酸替换为疏水性氨基酸，通过损伤a-螺旋之间相互作用从而破坏蛋白三维结构，抑制Erg3活性。

Upc2和Ndt80是白念珠菌ERG11等麦角甾醇生物合成基因(ERG基因)的关键转录因子，其功能获得性(gain of function，GOF)突变或过表达可显著上调ERG基因表达，从而导致唑类耐药[13-14]。与白念珠菌中的功能相似，Upc2和Ndt80亦调控近平滑念珠菌ERG基因——Branco等在唑类耐药株中敲除Upc2或Ndt80后，ERG基因表达显著降低且唑类MIC值均恢复到敏感水平；但与白念珠菌不同的是Ndt80主要调控近平滑念珠菌的ERG3、ERG25和ERG6，而对ERG11的调控作用较小，敲除株中ERG11水平仅下降30%[13,15-16]。目前，多项研究已发现唑类耐药临床株携带多个Upc2突变，但尚未证明是否为GOF突变[8,17]。

药物外排泵编码基因CDR1和MDR1过表达是念珠菌唑类耐药的另一关键因素，多由对应的转录因子Tac1和Mrr1发生GOF突变介导[18]。CDR1或MDR1对近平滑念珠菌唑类敏感性的调控功能与白念珠菌相同，但CDR1缺失对近平滑念珠菌氟康唑敏感性水平的增强程度远低于白念珠菌。目前已直接证明Mrr1的G583R、K873N和L779F是导致近平滑念珠菌唑类耐药的GOF突变，Grossman等[19-20]通过同源比对，认为近平滑念珠菌MRR1存在与白念珠菌和都柏林念珠菌相似的热点突变区域，位于氨基酸第852—875位。多项研究报道，氟康唑耐药株还特异性携带Tac1的A21V、N900D和P150H等突变、Mrr1的R405K、G927C、G583R、G927D和L986P等突变，但尚需进一步证明[11,17,19]。此外，Cdr1突变可能也与近平滑念珠菌耐药相关，例如N1163D突变株氟康唑MIC值较高[21]。

1.2 棘白菌素类药物

棘白菌素通过非竞争性抑制1，3-β-D-葡聚糖合成酶(Fks)，阻碍真菌细胞壁的合成。白念珠菌可通过降低Fks亲和力、改变细胞壁结构或成分、应激反应以及相关调控网络来实现抗性表型，其中Fks1或Fks2突变是耐药的主要原因[22]。蛋白同源分析推测，近平滑念珠菌Fks1的热点突变区(hotspot region，HS)位于第652—660位氨基酸(HS1)之间和1369—1376位之间(HS2)。近平滑念珠菌对棘白菌素的MIC值天然高于其他念珠菌，Garcia等[7]研究确证HS1的P660A固有突变是其主要原因。有研究发现，米卡芬净临床耐药株携带Fks1 R658G突变，但该突变与阿尼芬净耐药关系较弱[23]；体外诱导获得的卡泊芬净和阿尼芬净耐药株均携带Fks1 W1370R突变，但其同源突变W1358R仅导致白念珠菌和光滑念珠菌MIC值微弱变化[24]；临床耐药株在Fks1 HS外也存在突变，如靠近HS2的F1386S、跨膜结构域V595I，然而以上突变均缺乏验证[25]。目前，尚未发现近平滑临床株在Fks1 HS2和Fks2携带突变，Marti等[25]推测Fks2可能不参与近平滑念珠菌对棘白菌素敏感性的调控。此外，Chamilos等[26]发现菌株呼吸通路抑制剂可显著降低近平滑念珠菌对卡泊芬净MIC值，表明线粒体呼吸信号通路参与调控棘白菌素敏感性。

Erg3和MFS转运蛋白家族羟基苯甲酸转运体Hbt4被证明是近平滑念珠菌唑类和棘白菌素耐药的共同调控途径：Erg3缺失或发生G111R突变均导致唑类高度耐药和棘白菌素中介或耐药，而在白念珠菌中该基因仅影响唑类耐药[27]；HBT4缺失导致近平滑念珠菌对卡泊芬净敏感性升高和氟康唑耐药[28]。

1.3 多烯类与氟胞嘧啶类

两性霉素B和氟胞嘧啶在治疗念珠菌感染中应用较少，目前近平滑念珠菌对两种药物的敏感性相对较高，鲜有对其耐药机制的研究。近平滑念珠菌对两性霉素B的药物敏感性总体较高，大多临床株的生长能在较低药物浓度(0.4 μg/mL)下被抑制，然而Seidenfeld等[29]发现该药对近平滑念珠菌的最低杀菌浓度比MIC高32倍，证明该菌种对两性霉素B具有耐受性。Paul等[30]报道了1例近平滑念珠菌感染性心内膜炎患者接受5-氟胞嘧啶治疗后出现耐药，耐药株胞嘧啶脱氨酶活性丧失，仅为敏感株的7%，这可能是导致5-氟胞嘧啶耐药的机制。

1.4 生物膜

近平滑念珠菌易黏附于生物和非生物表面形成生物膜[4]，生物膜可通过与药物结合或空间隔离等方式，降低接触胞体的药物浓度，导致念珠菌耐药。研究表明，生物膜形成显著增加了近平滑念珠菌对两性霉素B、唑类和特比萘芬的耐药性；而棘白菌素可抑制生物膜的主要成分β-葡聚糖，从而降低生物膜代谢活性[31-32]。因此，生物膜形成的调控网络亦间接调控近平滑念珠菌的耐药性，如菌丝壁蛋白1(hyphal wall protein 1，Hwp1)、调控葡聚糖合成的转录因子Rlm和Smi1等。

2 毒力调控机制

2.1 形态

近平滑念珠菌存在酵母相和假菌丝相两种形态，两者间可以相互转换和交织共存。酵母相被认为是传播的主要形态，其组成的菌落呈光滑或凹坑型；假菌丝相是侵袭形态，其菌落呈皱缩型或同心圆型[33]。体外实验已证明，近平滑念珠菌假菌丝形态对宿主细胞损伤程度更高、生物膜形成和侵袭能力更强[34]。环境刺激如温度、血清和宿主内CO2浓度是白念珠菌形态转变的应激诱导条件，但在近平滑念珠菌中尚无研究。

研究表明，形态转化通常与细胞壁结构改变有关。光滑型近平滑念珠菌分离株HWP1重复区长度和重复数显著增加，而非光滑型菌株糖基磷脂酰肌醇锚定壁黏附素显著增加，该物质被证明与近平滑念珠菌假菌丝和生物膜形成、琼脂侵入能力密切相关[35-36]。白念珠菌酵母向丝状形态转换的调控转录因子Efg1(抑制转换)和Ume6(诱导菌丝生长)、正调节基因OCH1和CPH2以及负调节基因CWH41和SPT3在近平滑念珠菌中发挥相似功能[37-41]。转录因子Ndt80通过调控ALS3和HWP1促进菌丝生长，从而正调控白念珠菌的毒力，然而敲除Ndt80会导致近平滑念珠菌从光滑菌落/酵母形态变为皱褶菌落/假菌丝形态，Branco等[13,42]研究证明Ndt80通过抑制菌丝形成诱导因子UME6和CPH2的表达、同时激活同心圆型向光滑型转化的诱导转录因子Czf1和Efg1的表达，从而发挥对近平滑念珠菌形态转化和毒力的抑制功能。此外，多铜氧化酶基因FET3与白念珠菌毒力无关，但对近平滑念珠菌维持假菌丝形态和调控生物膜形成具有重要作用[43]。

2.2 黏附性

黏附是念珠菌在生物或非生物表面定植、生物膜形成和侵袭性感染的关键初始步骤。相比于其他念珠菌，近平滑念珠菌临床分离株的黏附性变异度异常大，其中来自人体皮肤处分离株黏附性比其他分离部位高[44]。

念珠菌黏附主要由其表面黏附素与宿主细胞的相应受体结合来完成，黏附素主要包括Hwp1、Hyr1和凝集素样序列蛋白(agglutinin-like sequence protein，Als)等。Hwp样蛋白Ywp1在生物膜形成能力弱的近平滑念珠菌菌株含量丰富，并且在假菌丝中含量显著低于酵母细胞，具有抗黏附功能[35]。近平滑念珠菌Als家族共存在5位成员，其编码基因为CPAR2_404770、CPAR2_404790、ALS7(CPAR2_404800)、CPAR2_400660和CPAR2_404780，这五种蛋白均在假菌丝表面显著富集，但仅前三者参与近平滑念珠菌对人类颊上皮细胞的黏附[45-46]。Als7与白念珠菌Als蛋白同源性最高，该蛋白表达量与近平滑念珠菌黏附程度呈正相关，并对菌株在血流剪切力下与宿主细胞的黏附起决定作用[46, 47]。CPAR2_404770也在非生物表面的黏附中发挥作用[46]。动物感染模型显示，仅CPAR2_404800与尿路感染致病力相关，而其余4个Als成员可促进阴道近平滑念珠菌病的发展[45-46,48]。转录因子Ndt80通过负调控ALS7抑制近平滑念珠菌的黏附，与白念珠菌中的功能相反[42]。此外，近平滑念珠菌株间ALS基因拷贝数变异度大(1～5个)，但目前变异度与毒力的关系尚未被证实。

另外，有研究表明细胞壁中的兼职功能蛋白烯醇化酶Eno1和糖酵解调节蛋白磷酸甘油酸激酶Pgk是近平滑念珠菌与硅胶材料植入物黏附的必需基因，同时Eno1也参与PVC装置的黏附[49]。

2.3 生物膜形成

生物膜既可抵抗抗菌药物，同时也具有保护念珠菌免受宿主免疫识别的功能。与白念珠菌由胞体和真菌丝构成的生物膜不同，近平滑念珠菌形成的生物膜较薄且结构相对简单，主要由聚集的芽孢、假菌丝和大量细胞外碳水化合物组成[50]。近平滑念珠菌极易在导管等医疗植入装置处形成生物膜，待有利环境条件下菌体随血流在体内进行播散，这是近平滑念珠菌的主要感染途径，目前近平滑念珠菌已成为造成导管相关性血流感染第1位的侵袭性念珠菌[4]。Soldini等[51]研究发现强或中等生物膜形成能力菌株感染的患者发生中心静脉导管相关真菌血症的比例更高(58.5%vs.34.5%)，且在菌血症发病后30 d内死亡较高(57.5%vs.33.3%)。此外，近平滑念珠菌也易在高糖或高脂介质、医疗设备和皮肤处形成生物膜并传播，目前已造成全球多家医院发生院内暴发[52]。

菌丝形成是生物膜形成的关键步骤，酵母相组成的光滑型菌株生物膜形成能力最弱，而菌丝形态组成的同心圆型菌株最强，其高生物膜形成能力可能与壁黏附素表达增加有关[33,35]。因此，非光滑菌落形态可作为启动近平滑念珠菌抗生物膜活性治疗指标，用药策略从唑类转换为棘白菌素[53]。

多项研究显示近平滑念珠菌与白念珠菌生物膜调控网络存在显著差异。转录因子Tec1、Rob1、Flo8和Brg1是白念珠菌生物膜发育的关键调控因子，但对近平滑念珠菌生物膜形成无调控功能。转录因子Cph2、Czf1、Gzf3和Ume6及蛋白激酶Mkc1对近平滑念珠菌生物膜形成具有重要调控作用，但在白念珠菌中无相似功能[39]。白念珠菌生物膜成熟必需的CFEM细胞壁蛋白家族如Rbt5、Pga10和Csa1，并非是近平滑念珠菌所必需的蛋白，该菌种所必需因子为Cph2、Bcr1和Efg1[39-40]。另外，转录因子Ndt80对两菌种生物膜调控功能相反，在白念珠菌中为正调控因子，而在近平滑念珠菌中则通过负调控MKC1、UME6、CPH2和ACE2，从而抑制生物膜形成[42]。目前研究显示仅Ace2、Bcr1和Efg1对两菌种具有相似功能[39]。

此外，海藻糖酶编码基因ATC1/NTC1、细胞壁表面蛋白Rbt1、多铜氧化酶编码基因FET3、CPAR2_107240(与白念珠菌KTR4/MNT4基因同源，调控细胞壁再生)、CPAR2_302400(与酿酒酵母编码DNA修复甲基转移酶的MGT1基因同源)、CPAR2_108840、CPAR2_406400和CPAR2_602820也被报道与近平滑念珠菌生物膜形成相关[43, 54-56]。

2.4 胞外水解酶的产生

念珠菌黏附到宿主上皮细胞后，菌丝会分泌水解酶，促进菌体侵袭宿主细胞。念珠菌的胞外水解酶主要有分泌性天冬氨酸蛋白酶(secreted aspartyl proteinases，Saps)、脂肪酶和磷脂酶，但近平滑念珠菌磷脂酶的表达量和其毒力程度无直接关系，该酶的致病作用仍存在争议[57]。

Saps被认为是念珠菌产生的水解酶中最有效的致病力增强因子，目前已在近平滑念珠菌中鉴定出3个成员Sapp1～3，该菌种的Saps偏好作用底物为参与激活级联反应的补体蛋白，而非补体控制蛋白[54,58]。Singh等[54]研究表明SAPP1和SAPP2是近平滑念珠菌在人血清中存活的必需基因，这两种酶能降解补体C3b、C4b和补体调节因子H，保护菌体逃脱宿主补体介导的免疫攻击，同时也具有促进黏附、抗巨噬细胞吞噬和杀伤能力以及损伤宿主细胞的功能。而Sapp3无上述功能，Silva等识别到该酶在人重组口腔上皮感染模型中表达量升高，但仍未发现其与毒力相关的直接证据[59]。此外，Saps还影响白念珠菌的菌丝和生物膜形成，但在近平滑念珠菌中无类似功能[54]。

脂肪酶是近平滑念珠菌另一重要的毒力因子，在侵袭过程中发挥抑制宿主细胞和体液免疫以及延迟炎症反应的作用[60]。近平滑念珠菌共存在4个分泌型脂肪酶编码基因，但仅LIP1和LIP2被证实能编码功能活性酶，两种酶的分泌量与近平滑念珠菌致病力增强显著相关[61-62]。Attila等研究表明LIP1和LIP2缺失会导致近平滑念珠菌在巨噬细胞共培养、人重组口腔上皮和小鼠腹腔感染模型中的存活率菌显著降低，共培养24 h后诱导巨噬细胞TNFα、IL-1β、IL-6和IL-10的表达量显著高于野生型[62-63]。LIP1和LIP2缺失也被证明显著抑制近平滑念珠菌在富脂质环境中的生物膜形成[62]。此外，Anne-Hélène等识别到Lip2的第369位氨基酸是酶活性的关键决定位点，发生S369E突变会导致该酶水解活性增加，而S369A则增加其醇解活性[64]。

Saps和真菌特异性脂肪酶可作为近平滑念珠菌感染治疗的潜在靶点。研究表明，蛋白酶抑制剂抑肽素A和利托那韦可抑制Sapp1活性，减少近平滑念珠菌对宿主的损伤；脂肪酶抑制剂厄比内酯B和阿司匹林可在近平滑念珠菌感染时保护人重组口腔上皮组织[65-67]。

3 小 结

虽然近平滑念珠菌与白念珠菌引起的侵袭性念珠菌病在临床表现上相似，但在感染途径、易感人群、传播方式及耐药和毒力等生物学特征方面存在显著差异。这些特性与该菌种近十年来感染发病率增高密切有关。

相关研究结果总体上表明，近平滑念珠菌的药物抵抗方式和毒力因子种类等与白念珠菌类似，且两菌种多数同源基因的功能相对保守；但在耐药和毒力调控网络方面存在显著差异，尤其是形态和生物膜形成的调控机制，这提示白念珠菌的研究结论不能轻易引申至近平滑念珠菌中。近平滑念珠菌特殊的生物膜特性不仅影响其感染的主要方式，还是耐药抵抗和水平传播的重要原因，很可能成为未来大范围暴发或者耐药激增的潜在危险因素。因此，研究者应更深入地研究近平滑念珠菌菌种特异性生物学特性及其调控机制，以便开发新的治疗靶点和方法。同时，也应长期监测该菌种耐药情况，以指导临床针对近平滑念珠菌定植或感染的预防和治疗。