UPLC-MS/MS法测定利奈唑胺原料和葡萄糖注射液中的叠氮类遗传毒性杂质

彭诗雁，陈 华，尹 婕*

（1中国药科大学药学院，南京 211198；2中国食品药品检定研究院，国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室，北京 102629）

利奈唑胺是一种人工合成唑烷类抗菌药，主要用于治疗革兰氏阳性球菌引起的感染，包括医院获得性肺炎、社区获得性肺炎、复杂性皮肤和皮肤软组织感染以及耐万古霉素肠球菌感染等，其结构式见图1。利奈唑胺抗菌机制为通过与30S和50S核糖体亚基上的rRNA结合以抑制细菌蛋白质的合成，其优点在于不易与其他机制相同的抗菌药产生交叉耐药性，且在体外亦不易产生细菌耐药性［1］。目前，《中华人民共和国药典》（2020年版）并未收载利奈唑胺，国外药典仅有《美国药典》（USP）收载了利奈唑胺原料药。

利奈唑胺的一种合成途径是以吗啉和3，4-二氟硝基苯为起始原料，使用叠氮试剂，从而生成合成中间体（R）-5-（叠氮甲基）-3-［3-氟-4-（4-吗啉基）苯基］-2-唑烷酮（利奈唑胺USP 杂质A，结构见图1）［2］。采用Derek Nexus 和Sarah Nexus 软件对利奈唑胺USP杂质A进行定量构效关系评估，结果均为阳性且评估报告显示该杂质警示结构为叠氮基团。后根据人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）于2017年发布的《评估和控制药物中DNA反应性（致突变）杂质以限制潜在致癌风险指南M7（R1）》［3］对利奈唑胺USP杂质A进行体外鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames 试验），试验结果呈阳性，表明其具有体外致突变性，为第二类遗传毒性杂质，故需严格控制其含量。《利奈唑胺抗结核治疗专家共识》［4］建议使用利奈唑胺治疗疗程不超过24 个月，而《评估和控制药物中DNA 反应性（致突变）杂质以限制潜在致癌风险指南M7（R1）》中根据药物暴露周期科学地控制遗传毒性杂质含量而提出的可接受摄入量及限度的计算方法，采用毒理学关注阈值（threshold of toxicological concern，TTC）10 µg/d 作为每日可接受摄入量，利奈唑胺每日最高服用剂量应不大于1 200 mg，故计算得利奈唑胺杂质A限度为8.3 ng/mL。

Figure 1 Chemical structures of linezolid(A) and linezolid USP impurity A (B)

国内现有的利奈唑胺有关药品质量标准和USP 中并未将利奈唑胺USP 杂质A 作为特定杂质控制。因此，本研究拟建立一种检测利奈唑胺原料及葡萄糖注射液中痕量遗传毒性杂质利奈唑胺USP杂质A的高灵敏度分析方法，以保证利奈唑胺原料及其葡萄糖注射液中遗传毒性风险杂质的可控性。

利奈唑胺有关药品质量标准均采用高效液相色谱法检测其原料及制剂中的有关物质，耗时较长且灵敏度较低，难以实现利奈唑胺遗传毒性杂质的痕量检测。而液相和质谱检测器联用可具有更高的选择性和灵敏度，可弥补传统检测方法的不足，适用于痕量遗传毒性杂质的检测。

1 材 料

1.1 药品与试剂

乙腈（LC-MS 级，美国Honeywell 公司）；甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；去离子水（Milli-Q纯水仪）；（R）-5-（叠氮甲基）-3-［3-氟-4-（4-吗啉基）苯基］-2-唑烷酮（纯度：99.88%，批号：K1905171，中国Aladdin 公司）；利奈唑胺原料［江苏正大丰海制药有限公司（批号：2112012）；江苏豪森制药股份有限公司（批号：LZ-220201）］；利奈唑胺葡萄糖注射液（江苏正大丰海制药有限公司；批号：1901081、1901082、1901091；规格：300 mL，含利奈唑胺0.6 g与葡萄糖15.072 g）。

1.2 仪 器

Waters I Class/Xevo TQ-S UPLC-MS/MS（美 国Waters 公司）；十万分之一电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；超纯水仪（美国Millipore公司）。

2 方 法

2.1 液相条件

色 谱柱 为Waters Acquity UPLC HSS T3（100 mm × 2.1 mm，1.8 µm）；流动相为0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液（60∶40），等度洗脱；流速为0.3 mL/min，柱温为30 ℃；进样盘温度为10 ℃；进样量为1 µL。

2.2 质谱条件

扫描方式：电喷雾（ESI）离子源，正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.20 kV；电喷雾离子源温度150 ℃；去溶剂温度：500 ℃；去溶剂气流速：1 000 L/h；锥孔气流速：150 L/h；MRM参数见表 1。

Table 1 MS/MS acquisition parameters of linezolid USP impurity A

2.3 溶液制备

稀释剂：取水与乙腈，以体积比60∶40 混合均匀，即得。

对照品储备液：精密称取利奈唑胺USP杂质A适量，加稀释剂溶解并稀释制成每毫升中含利奈唑胺USP杂质A 160 ng的溶液。

对照品溶液：精密量取对照品储备液适量，加稀释剂定量稀释制成每毫升中含利奈唑胺USP 杂质A 8 ng的溶液。

供试品溶液：精密称取利奈唑胺原料及量取利奈唑胺葡萄糖注射液适量，分别加稀释剂溶解并稀释制成每毫升中含利奈唑胺约1 mg的溶液。

系统适用性溶液：精密量取利奈唑胺葡萄糖注射液约5 mL 置于10 mL 量瓶中，精密加入对照品储备液0.5 mL，加稀释剂至刻度，摇匀。

线性系列对照品溶液：精密量取对照品储备液适量，加稀释剂定量稀释制成利奈唑胺USP 杂质A 质量浓度分别为12、10.8、9.6、8、6.4、5.2 和4 ng/mL的溶液。

检出限（LOQ）及定量限（LOD）溶液：精密量取对照溶液适量，加稀释剂定量稀释制成质量浓度约0.04 ng/mL的LOD溶液和质量浓度约为0.1 ng/mL的LOQ溶液。

回收率加样溶液：精密量取9 份利奈唑胺葡萄糖注射液约5 mL，分别置于9 个10 mL 量瓶中，后分别精密加入对照品储备液0.4、0.5、0.6 mL各3份，加稀释剂至刻度，得低（80%限度浓度）、中（100%限度浓度）、高（120%限度浓度）浓度加样溶液。

加样重复性溶液：精密量取6份利奈唑胺葡萄糖注射液约5 mL，分别置于6 个10 mL 量瓶中，后分别精密加入对照品储备液0.5 mL，加稀释剂至刻度。

稳定性溶液：精密量取对照品储备液0.5 mL共4 份，分别置于10 mL 量瓶中，各加入利奈唑胺葡萄糖注射液5 mL，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，其中2 份置于10 ℃条件保存，另外2 份置于常温保存。

3 结 果

3.1 专属性

分别取稀释剂、对照品溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、LOD 溶液和LOQ 溶液在建立的 UPLC-MS/MS 方法下进样测定。结果表明，在所建立的色谱-质谱条件下，利奈唑胺USP 杂质A 峰形良好，空白稀释剂、供试品溶液对利奈唑胺USP 杂质A的检测无干扰（图2）。

3.2 线性关系

取杂质线性系列对照品溶液在建立的UPLCMS/MS 方法下进样测定，以MRM 离子流峰面积（Y）为纵坐标，以利奈唑胺USP 杂质A 的对照品浓度（X，ng/mL）为横坐标，计算线性回归方程。结果表明，利奈唑胺USP 杂质A 在4 ~ 12 ng/mL 内质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，所得回归方程为：Y= 5 434.4X+ 394.52，r= 0.999 6。

3.3 检出限及定量限

取LOD 溶液和LOQ 溶液，在建立的UPLC-MS/MS 方法下进样测定，计算检出限及定量限。结果表明利奈唑胺USP 杂质A 的LOD 和LOQ 分别为0.022 ng/mL 和0.073 ng/mL，该方法的灵敏度满足检测要求。

Figure 2 Typical chromatogram of solutions detected by UPLC-MS/MS

3.4 回收率

取回收率加样溶液在建立的UPLC-MS/MS 方法下进样测定。结果表明低、中、高浓度加样溶液平均回收率分别为101.14%、100.59% 和101.47%，相对标准偏差（RSD）分别为0.73%、1.10%和0.91%，该方法具有较好的回收率。

3.5 加样重复性

取平行制备的6 份加样溶液，在建立的UPLCMS/MS 方法下进样测定。结果表明6 份加样重复性溶液RSD为1.09%，该方法具有较好的重复性。

3.6 稳定性

3.6.1 样品日内稳定性 取10 ℃和室温保存的稳定性溶液各1 份，分别于 0、2、6、10 和24 h 在建立的UPLC-MS/MS方法下进行测定，并按照对照品溶液项下方法配制随行对照品溶液计算溶液加样回收率的RSD。结果表明，10 ℃和室温条件下保存溶液的加样回收率RSD 分别为0.72% 和1.38%，可见样品在10 ℃和室温条件下保存24 h稳定。

3.6.2 样品日间稳定性 另取10 ℃和室温保存的稳定性溶液各1份，分别于 0、1、2、3和6 d在建立的UPLC-MS/MS 方法下进行测定，并按照对照品溶液项下方法配制随行对照品溶液计算溶液加样回收率的RSD。结果表明，10 ℃和室温条件下保存溶液的加样回收率RSD 分别为0.94%和1.35%，可见样品在10 ℃和室温条件下保存6 d稳定。

3.7 耐用性

取1 份中浓度回收率加样溶液，分别改变液相色谱柱［改用Acquity UPLC HSS T3 （150 mm × 2.1 mm，1.8 µm，Serial No 02553117418342）色谱柱 及Acquity UPLC HSS T3 （100 mm × 2.1 mm，1.8 µm，Serial No 02013730718374）色谱柱］，改变流速（ ± 0.03 mL/min），改变柱温（ ± 5 ℃），在建立的UPLC-MS/MS方法下进行测定，考察方法的耐用性。结果表明，在上述条件下加样回收率为98.21% ~ 103.15%，RSD 为1.84%，可见该方法耐用性良好。

3.8 样品测定

取2 批利奈唑胺原料和3 批利奈唑胺葡萄糖注射液制备供试品溶液并进行测定，采用外标法计算利奈唑胺USP 杂质A 含量。结果表明，在2 批利奈唑胺原料及3 批利奈唑胺葡萄糖注射液中均未检出利奈唑胺USP杂质A。

4 讨 论

为实现利奈唑胺USP杂质A的痕量检测，本实验对该杂质质谱MRM 模式选用离子进行了确认，并在标准提供的高效液相色谱条件的基础上进行了液相色谱条件的优化。

4.1 利奈唑胺USP杂质A定性研究

对利奈唑胺USP杂质A进行手动调谐定性，得到检测母离子、子离子及其电离电压，由于子离子m/z165.1 响应最高，故将其作为定量离子进行检测。

4.2 液相色谱条件研究

现有利奈唑胺相关标准中多采用0.1%三氟乙酸水溶液-0.1%三氟乙酸乙腈溶液为流动相进行梯度洗脱来检测利奈唑胺中的有关物质，由于三氟乙酸在一定浓度范围内可能会抑制化合物电离，故为提高电离效率，最终选择甲酸代替三氟乙酸进行流动相配制。但经实验证明，新的梯度洗脱条件导致利奈唑胺USP 杂质A 在检测过程中存在干扰峰现象，综合考虑检验时间和灵敏度后最终选择等度洗脱检测目标杂质。

后续对等度洗脱的流动相组成进行了筛选，备选的0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液洗脱体积比分别为20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40和70∶30。结果显示，随着0.1%甲酸乙腈溶液体积比的增大，利奈唑胺USP 杂质A 保留时间会相应延长，利奈唑胺与利奈唑胺USP 杂质A 分离度会更好，故基于主成分和目标化合物分离度及检测效率的考虑，最终选择流动相体积比60∶40进行等度洗脱。此外，为避免主成分的干扰和污染，设置六通阀将0 ~ 2.7 min 时间段内的流出物切换到废液通道。

本实验建立的UPLC-MS/MS 法具有较好的线性、灵敏度、回收率及重复性，可以同时用于检测利奈唑胺原料及其制剂中的遗传毒性杂质含量，可为利奈唑胺原料及制剂的质量控制提供参考。