新风胶囊通过调节Notch1通路、巨噬细胞极化改善类风湿关节炎大鼠关节炎症*

赵磊，万磊，刘健，黄传兵，马熙檬，朱子衡，李舒，李方泽，葛瑶，刘天阳，刘磊，李明

1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230038； 2.安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥 230031

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种复杂的慢性炎症性自身免疫性疾病，常累及小关节，病变呈对称性、侵袭性和致残性，其特征是明显的滑膜增生和关节滑膜炎，是炎症细胞因子显著过度生产导致骨和软骨破坏的结果[1-2]。RA患者的滑膜中存在着大量巨噬细胞，参与RA炎性反应的多个阶段和环节，在RA发生发展过程中发挥着重要的作用，与RA疾病活动密切相关。巨噬细胞极化可分泌大量促炎性细胞因子、趋化因子，激活成纤维细胞和破骨细胞，加速机体炎症反应，造成关节破坏[3-4]。Notch信号通路出现在大多数生物中，参与调节分化、增殖、黏附、凋亡等各种细胞过程，在包括免疫反应、炎症性疾病等在内的疾病中起着关键作用[5-6]。研究表明，Notch1在滑膜组织和活化的巨噬细胞中过表达[7]。

中医药通过整体调节作用在治疗RA时发挥疗效好、价格便宜、副作用少等优点，广泛应用于临床。新风胶囊为新安医家刘健教授据多年临床经验所创，由雷公藤、黄芪、薏苡仁、蜈蚣配伍组成，具有健脾化湿通络之功效。前期临床及动物实验表明，新风胶囊能明显改善RA患者关节肿胀、晨僵、滑膜炎症反应等，降低关节炎大鼠炎症反应，调节炎症极化状态，还可通过调节Notch信号转导通路下调Notch1、Hes1蛋白的表达，降低致炎介质转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的水平，从而抑制炎症反应，延缓RA发病进程[8-9]。本研究通过考察新风胶囊对RA大鼠关节炎症的影响探讨其治疗RA的作用机制。

1 材料

1.1 动物清洁级雄性SD大鼠32只，体质量 (190±20) g，由安徽医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：Lscxk (皖) 2017-001。标准清洁级动物房饲养，温度18～22 ℃，相对湿度50%～60%，保持通风排气10～20次·h-1。本实验通过安徽中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会的批准，动物伦理编号：AHUCM-rats-2021022。

1.2 药物与试剂新风胶囊(安徽中医药大学第一附属医院制剂中心，批号：191015)；甲氨蝶呤(上海上药信谊药厂有限公司，批号：191213)。弗氏完全佐剂(美国Sigma公司，货号MB9887)；白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-10、IL-23、TGF-β 试剂盒(武汉基因美公司，货号：JYM0419Ra、JYM0651Ra、JYM0297Ra、JYM0636Ra)；CD68-FITC、CD80-PE、CD163-AF647、兔Notch1抗体(美国santa cruz生物技术公司，货号：SC-20060FITC、SC-18866 PE、SC-20066 AF647、SC-32745)；兔Hes1抗体(美国abcam公司，货号：ab108937)。

1.3 仪器流式细胞仪(美国贝克曼库尔特有限公司，型号：navios)；倒置显微镜(日本OLYMPUS公司，型号：CKX31)；离心机(上海和欣科教设备有限公司，型号：80-2)。

2 方法

2.1 动物分组、造模及给药按照随机对照表将32只大鼠随机分为正常组、模型组、甲氨蝶呤组和新风胶囊组，每组8只。除正常组外，其余组大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(每只0.1 mL)以致炎，构建类风湿关节炎大鼠模型[10-11]。致炎后第12天开始给药，将新风胶囊粉末溶于0.9%氯化钠溶液制成0.34 g·L-1混悬液；甲氨蝶呤研成细粉后，将细末溶于0.9%氯化钠溶液制成0.95 mg·L-1混悬液。按10 mL·kg-1灌胃给药，新风胶囊组每天1次，甲氨蝶呤组每周1次，正常组及模型组给予生理盐水10 mL·kg-1灌胃，每天1次，给药周期30 d。

2.2 大鼠足跖肿胀度、关节炎指数的测定给药后30 d测量各组大鼠足跖肿胀度、关节炎指数[12]。足跖肿胀度=(造模后足趾容积-造模前足趾容积)/造模前足趾容积。关节炎病变指数按5级评分法评价，无红肿现象为0分，小趾关节出现红肿为1分，趾关节和足跖出现肿胀为2分，踝关节以下的足爪发生肿胀为3分，包括踝关节在内的全部足爪发生肿胀为4分。

2.3 关节病理学观察各组大鼠取右后足远端趾间关节，用4%多聚甲醛固定24 h后，10%乙二胺四乙酸脱钙，石蜡包埋，切片(修、切、展、贴、烤片)，HE染色，中性树胶封片，显微镜观察大鼠关节滑膜及软骨组织病理形态变化。

2.4 流式细胞术检测大鼠外周血炎症极化标志物CD80+细胞、CD163+细胞的表达取大鼠新鲜血液100 μL，按1×106个细胞/管分别加入 CD80-PE、CD163-AF647抗体。按照说明书操作，采用EPICS型流式细胞仪检测。用flowJoV10软件对流式细胞图像进行分析，统计CD80+细胞、CD163+细胞与淋巴细胞比值作为M1、M2型巨噬细胞相对表达量。

2.5 ELISA法检测大鼠血清细胞因子IL-1、IL-23、IL-10、TGF-β的表达腹主动脉采血，离心取上清液，依照ELISA试剂盒说明操作检测IL-1、IL-23、IL-10、TGF-β的OD值，绘制IL-1、IL-23、IL-10、TGF-β标准曲线，测算出大鼠血清 IL-1、IL-23、IL-10、TGF-β浓度。

2.6 Western Blot检测Notch1、Hes1蛋白表达水平用蛋白提取试剂盒提取滑膜总蛋白，电泳分离，采用半干法转膜使蛋白质从胶转移至膜上，用室温5%的脱脂奶粉封闭膜2 h。免疫反应：将Notch1、Hes1抗体1：2 000稀释后和膜一起室温下孵育 2 h，加入二抗(稀释比例为1：8 000)室温孵育1 h。采用增强化学发光法显色并拍照。计算各组Notch1、Hes1条带的灰度值，以目的条带与内参β-actin灰度值的比值做为滑膜Notch1、Hes1蛋白的相对表达量。

3 结果

3.1 新风胶囊对RA大鼠关节炎症的影响与正常组比较，模型组RA大鼠足趾肿胀度、关节炎指数显著升高(P<0.01)；与模型组比较，新风胶囊组大鼠足趾肿胀度、关节炎指数显著降低(P<0.01)。见表1。

表1 各组大鼠足跖肿胀度、关节炎指数比较

3.2 新风胶囊对关节滑膜病理变化的影响HE染色显示，正常组大鼠关节滑膜组织结构清晰，滑膜无肥大、突起，无炎性细胞浸润，滑膜细胞分界清楚，分层较少；模型组大鼠关节滑膜可见大量炎性细胞浸润，多为嗜酸性细胞和中性粒细胞，滑膜血管增多，血管壁及其周围附属组织可见大量炎性细胞浸润，滑膜衬细胞分层增多；新风胶囊组大鼠的关节结构较为完整，滑膜细胞排列比较整齐，关节滑膜、血管壁出现少量炎性细胞浸润，关节面整体结构较为规整；甲氨蝶呤组大鼠关节面滑膜细胞排列较整齐，关节面较模糊，部分关节软骨处可见血管翳形成。见图1。

图1 HE染色观察各组大鼠足趾关节病理形态学变化(×200)

3.3 新风胶囊对RA大鼠M1、M2表面标志物的影响与正常组比较，模型组RA大鼠CD80+细胞表达明显升高(P<0.01)，CD163+细胞表达明显降低(P<0.01)；与模型组比较，新风胶囊组CD80+细胞表达明显降低(P<0.01)，CD163+细胞表达明显升高(P<0.05)。见表2，图2，图3。

图2 大鼠外周血M1巨噬细胞标记物CD80+细胞表达

图3 大鼠外周血M2巨噬细胞标记物CD163+细胞表达

表2 各组大鼠M1、M2表面标志物的比较

3.4 新风胶囊对RA大鼠IL-1、IL-23、IL-10、 TGF-β水平的影响与正常组比较，模型组大鼠IL-1、IL-23、TGF-β表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01)，IL-10表达水平明显降低(P<0.01)；与模型组比较，新风胶囊组IL-1、IL-23、TGF-β表达水平明显降低(P<0.05)，IL-10表达水平明显升高(P<0.01)。见表3。

表3 各组大鼠血清IL-1、IL-23、IL-10及TGF-β水平比较

3.5 新风胶囊对RA大鼠关节滑膜组织中Notch1、Hes1蛋白的影响与正常组比较，模型组大鼠滑膜组织中Notch1、Hes1蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，新风胶囊组滑膜组织中Notch1、Hes1蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见表4，图4。

表4 各组大鼠Notch1、Hes1蛋白表达水平比较

图4 Notch1、Hes1蛋白条带图

4 讨论

RA是一种自身免疫性炎症性关节疾病，可通过巨噬细胞浸润、淋巴细胞聚集及滑膜成纤维细胞的过度增殖促进IL-1、IL-23等炎症细胞因子的分泌，造成局部和全身性骨丢失，最终导致关节侵蚀和破坏[13-15]。IL-1是早期关节炎的重要触发因子，RA患者血液和关节滑膜液中均可检测到IL-1的表达升高。IL-1还可和TNF-α共刺激滑膜巨噬细胞的分化，促进破骨细胞形成，从而导致RA滑膜、软骨的破坏[16-17]。IL-23能够通过激活细胞核转录因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)-骨保护素(osteoprotegerin，OPG)系统促进破骨细胞形成，导致过度骨吸收，加速RA骨丢失[18-19]。

RA 属于中医“痹证”范畴，多呈现“脾虚湿盛、痰瘀胶着”的证候学特征。针对RA病机特征，具有健脾益气、化湿通络功效的中药新风胶囊被创制，且临床疗效确切[20-21]。君药黄芪、薏苡仁及其单体有效成分能抑制促炎因子IL-1β的表达，提高抗炎因子IL-10水平，具有免疫调节、抗炎等多种生理功能，抑制大鼠滑膜细胞过度增殖，减轻炎症反应[22-24]。臣药雷公藤及蜈蚣对消除RA炎症具有重要作用，现代药理学研究表明，雷公藤甲素可通过降低RA成纤维样滑膜细胞中miR-221及炎症因子的表达来调节软骨细胞的增殖和分泌，从而抑制炎症并缓解RA症状[25]；蜈蚣提取物可通过减弱NF-κB信号通路的激活和抑制体内外促炎介质的产生来发挥抗炎症的作用，从而达到控制病情进展的目的[26]。

在体内外不同环境因素的影响下，巨噬细胞可极化成M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞两个亚群，M1巨噬细胞常见的标志物有CD80+细胞，可分泌大量促炎性细胞因子(如IL-1、IL-23、TGF-β)，激活成纤维细胞和破骨细胞，加速机体炎症反应，造成关节破坏。M2巨噬细胞常见的标志物有CD163+细胞，通过大量产生抗炎细胞因子(主要是IL-10)，促进血管生成、组织重塑和修复[27]。在γ分泌蛋白酶的介导下，Notch受体(Notch1到Notch4)与配体(Delta1、Delta3、Delta4及Jagged1-2)相互作用，结合下游信号蛋白形成转录复合物，与转录因子结合，影响下游靶基因Hes1的表达，激活Notch信号通路，致巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞，促进炎症细胞因子表达，加重RA炎症反应[28-29]。研究表明，当Notch1通路被抑制时，巨噬细胞极化同时被抑制，炎性细胞因子的水平明显降低，IL-10水平升高[6]。

本研究发现，经新风胶囊治疗后，RA大鼠关节炎指数和足趾肿胀度症状得到显著改善，M1型巨噬细胞表面标志物CD80+细胞及其炎性细胞因子 IL-1、IL-23等水平显著降低，M2型巨噬细胞表面标志物CD163+细胞及其抗炎细胞因子IL-10等表达显著升高，同时Notch1、Hes1的表达降低，说明新风胶囊能通过调节Notch1通路、巨噬细胞极化改善类风湿关节炎大鼠关节炎症。

综上所述，新风胶囊可能通过抑制Notch1通路、巨噬细胞极化，降低关节滑膜炎症反应，抑制关节炎症反应，改善RA关节炎症。