牙龈成纤维细胞诱导分化神经细胞的可行性

石俊 关振群 王训霞 张为新

(1青岛市海慈医疗集团青岛市中医医院口腔科，山东 青岛 266000；2南京医科大学附属苏州科技城医院口腔科)

神经组织是构成神经系统的重要成分，主要由神经细胞及神经胶质细胞构成。神经细胞可进行信息接收、整合，并进行信息传导，但是神经细胞在发生损伤后很难再生，导致神经系统损伤后再次修复成为临床研究的难题〔1〕。因此，寻找一种增殖能力强、安全、易采集，且可分化为神经细胞的细胞非常关键，以实现临床神经修复治疗〔2〕。有学者尝试将胚胎干细胞及骨髓间充质干细胞诱导为神经细胞，但研究中发现，此类细胞诱导的神经细胞在移植后极易出现多种并发症，如畸胎瘤等，且样本获取难度大，对患者机体造成损伤明显〔3〕。有学者指出，牙龈成纤维细胞具有很高的分化潜能，可进行多向分化，与胚胎干细胞及骨髓干细胞相比获取途径简单〔4〕。本研究选取阻生齿拔除患者牙龈组织，对其进行培养诱导，通过观察细胞形态、检测神经递质分析牙龈成纤维细胞诱导分化为神经细胞的可行性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取青岛市海慈医疗集团青岛市中医医院2018年5月至2019年12月收治的阻生齿拔除患者，取其周围正常牙龈组织作为研究样本，其中男6例，女4例，年龄19～32岁，平均(24.5±1.5)岁。纳入标准：(1)入组患者均经阻生齿拔除治疗；(2)患者无口腔炎症；(3)患者对于本次研究内容知情并同意。排除标准：(1)患者曾患有严重的口腔疾病，如口腔肿瘤；(2)患者存在精神障碍或沟通障碍；(3)患者存在影响细胞结构的相关疾病。本研究已获得医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1原代培养牙龈成纤维细胞 对获取组织进行原代培养，选择组织贴壁法，低糖DMEM培养液，在培养液中加入15%胎牛血清，使用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗所得组织，取含高浓度双抗的低糖DMEM培养液，浸泡组织20 min，取组织置于培养皿中，将组织上的残留血管、上皮组织去除，制成组织小块，移入培养瓶中，置于37℃环境中，二氧化碳浓度为5%，4 h后轻翻培养瓶，培养液每3 d进行1次更换，每次更换注意没过组织，使用显微镜观察是否存在细胞移出情况。

1.2.2传代培养牙龈成纤维细胞 对培养瓶中细胞培养结果进行密切观察，确定其长至80%融合时进行分解，分解取胰蛋白酶，浓度为0.25%，继续进行传代培养，比例为1∶3，对人牙龈成纤维细胞培养液进行收集，置于-20℃环境中存储，并将其记为对照组。

1.2.3鉴定人牙龈成纤维细胞 制备人牙龈成纤维细胞爬片，选择对数生长期第4代的细胞，使用浓度为0.25%的胰酶进行消化，制成细胞悬液接种于培养皿中，静置30 min，加入完全培养液至培养皿中，剂量完全覆盖玻片。将培养皿放置于培养箱中，待细胞长至60%时去除培养液，使用PBS进行3次冲洗，使用丙酮进行24 h固定。免疫细胞化学染色，将固定好的爬片使用PBS进行数次冲洗，按照免疫组化法检测试剂盒进行操作，显微镜下观察染色结果，并对染色结果进行拍照。

1.2.4牙龈成纤维细胞的诱导培养 诱导时选择第4代对数生长期的细胞，取低糖DMEM培养液，加入15%的胎牛血清，将1 mmol/L的β-巯基乙醇(ME)及20 μmol/L维甲酸加入培养液中，使用浓度为2%的DMEM进行诱导，时间为12 d，每48 h进行1次换液，每次换液后在倒置显微镜下进行观察，对神经样细胞培养液进行收集，置于-20℃冰箱中待检，该组记为诱导组。

1.2.5鉴定神经样细胞 免疫荧光化学法鉴定：取诱导12 d的细胞制成爬片，使用丙酮进行24 h固定，使用PBS进行洗涤，2 min/次，洗涤3次，孵育切片后，依次加入一抗、二抗，孵育期间注意避光，完成染色后使用甘油封片，并在显微镜下进行染色观察，拍片。免疫细胞化学法鉴定：在对人牙龈纤维细胞进行12 d诱导后，制备细胞爬片，方法与上文中一致，分别加入鼠抗人胶质纤维酸性蛋白(GFAP)单克隆抗体、鼠抗人vimentin单克隆抗体及鼠抗人人微管相关蛋白(MAP)-2单克隆抗体，进行免疫细胞化学染色，记录染色结果。采用酶联免疫吸附试验对神经样细胞分泌功能进行测定：对诱导后的神经样细胞培养液及人牙龈成纤维细胞培养液进行测定，离心处理对照组细胞培养液(人牙龈成纤维细胞)及诱导组(神经样细胞)培养液，进行20 min离心处理，转速3 000 r/min，按要求加样。取两组待测样品，分别设置12个样本孔，对待测样本进行稀释处理，在样本孔中加入酶标试剂，封板孵育，完成孵育后进行显色处理，测定吸光度，计算每组吸光度数值平均值，整理数据，对神经递质浓度含量进行计算。

1.3统计学方法 采用SPSS18.0软件进行χ2检验、t检验。

2 结 果

2.1培养及鉴定人牙龈成纤维细胞

2.1.1人牙龈成纤维细胞原代培养结果分析 在进行原代培养5～7 d时可观察到细胞爬出，细胞有突起，胞体呈纺锤形或梭形，存在明显的细胞轮廓，核呈卵圆形，细胞体及细胞核均较大，有明显核仁，着色浅。游离细胞数量随时间延长逐渐增多，生长方向为同一方向，呈簇样生长，见图1。

2.1.2传代培养人牙龈成纤维细胞 在确定培养瓶中细胞生长达到要求时进行传代培养，传代培养期间细胞生长良好，细胞器丰富，增殖旺盛，在培养2～3 d后进行传代培养，见图1。

图1 原代及传代培养人牙龈成纤维细胞

2.1.3免疫细胞化学染色鉴定人牙龈成纤维细胞 人牙龈成纤维细胞经染色显示为vimentin表达阳性，细胞核为被染为蓝色，细胞胞质被染为棕黄色。人牙龈成纤维细胞呈GFAP表达阴性，细胞核被染为蓝色，而细胞胞质未染色。人牙龈成纤维细胞呈MAP-2表达阴性，细胞核被染为蓝色，细胞胞质未被染色，见图2。

A、B：vimentin阳性；C、D：GFAP阴性，细胞呈梭形；E、F：MAP-2阴性图2 免疫细胞化学染色鉴定人牙龈成纤维细胞(×400)

2.2诱导人牙龈成纤维细胞分化为神经细胞

2.2.1在诱导后第5天便可观察到成纤维细胞胞体发生转变，部分细胞由原来的梭形转变为星形或三角形，细胞由原本的2个突起增长为3个及以上，细胞核变圆，突起细长，出现轴突样和树突样结构，且互相连接，呈现网状结构，且随诱导时间延长，其呈现神经样细胞改变越明显，在诱导第12天，几乎无梭形细胞存在，细胞形态均改变为神经样细胞形态，见图3。

A、B：胞体呈三角形或多边形，多突起，连成网；C、D：胞体呈三角形，细胞多突起；E、F：胞体呈多边形，细胞突起尖细长；G、H：胞体呈多边形，多突起图3 成纤维细胞胞体形态逐渐成为神经样细胞形态(×400)

2.2.2对诱导产生的神经样细胞进行胰酶消化，还可对细胞继续进行传代培养，神经样细胞经传代培养后7 d会出现凋亡情况。

2.3鉴定神经样细胞

2.3.1采用免疫细胞化学法鉴定神经样细胞 经染色显示，神经样细胞为vimentin表达阳性，细胞核被染为蓝色，胞质染为棕黄色；经染色显示神经样细胞GFAP表达阳性，细胞核被染为蓝色，胞质被染为棕黄色；经染色显示神经样细胞MAP-2表达阳性，细胞核被染为蓝色，胞质被染为棕黄色，见图4。

2.3.2采用免疫荧光化学法鉴定神经样细胞 经染色显示，神经阳性细胞为GFAP表达阳性，且细胞核被染为蓝色，胞质为绿色荧光染色；经染色显示，神经阳性细胞为MAP-2表达阳性，细胞核被染为蓝色，胞质为红色荧光，见图5。

图5 免疫荧光染色发现神经样细胞GFAP、MAP-2表达阳性(×200)

2.3.3酶联免疫吸附试验检测神经细胞分泌的神经递质 诱导组乙酰胆碱及多巴胺浓度〔(75.6±3.8)、(56.2±3.8)pg/ml)〕均明显高于对照组〔(12.6±1.7)、(8.9±1.1)pg/ml；均P<0.05〕。

3 讨 论

多种疾病可导致神经损伤发生，而神经细胞往往不可再生，因此寻找一种良好治疗方案对于改善神经损伤有着非常重要的意义。细胞移植可有效补充患者神经细胞，改善患者预后，但是如何诱导可移植的神经细胞一直以来都是临床研究的难题〔5〕。干细胞由成体干细胞和胚胎干细胞组成，其功能不同又可分为多种干细胞，在皮肤、骨髓、神经、脂肪等多种组织中均存在成体干细胞〔6〕。有研究指出，对牙髓细胞进行培养可分化为牙髓干细胞，随技术不断成熟，已在口腔牙龈的固有层中发现未分化的间充质干细胞〔7〕。有研究指出，采用绿色荧光蛋白进行标记，将标记后的体外培养人牙龈间质干细胞植入到牙周，发现其可有效修复牙周膜及牙骨质〔8〕。成体干细胞具有多向分化潜能，可塑性很强，在达到一定条件时可与不同胚层及相同胚层起源的成体干细胞进行互相转换〔9〕。有报道指出，牙龈成纤维细胞具有分化为血管内皮细胞、软骨细胞、骨细胞及骨骼肌细胞等潜能〔10〕。结合以往研究可以看出，牙龈成纤维细胞具有多向分化潜能，且在样本取样方面具有一定优势〔11〕。

神经细胞在人体中发挥重要作用，主要负责信息传导，从而构成了意识、思想、感觉及复杂运动等，但是在发生神经损伤后其自愈能力差，增加其修复难度〔12〕。通过对人牙龈成纤维细胞进行诱导培养可分化为多种细胞类型。神经细胞主要由轴突、树突、胞体3部分组成，每个神经细胞含有一个轴突，多个树突。本研究发现，在完成诱导后形成的神经样细胞胞体由原来的梭形变为三角形或多边形，细胞伸出突起，且突起之间相互连接形成网状，其结构与神经细胞的轴突、树突样结构一致。牙龈成纤维细胞表面存在特异性标志物，且呈现vimentin蛋白阳性，可看出在正常生理条件下的牙龈成纤维细胞中存在vimentin蛋白，而进行进一步分析时发现，牙龈成纤维细胞中不含神经胶质细胞特异性表面标志物GFAP及神经元特异性表面标志物MAP-2，经免疫组化法检测显示为阴性。进一步证实本研究所获取的牙龈成纤维细胞为结缔组织细胞，而并非神经组织来源。在完成诱导后再次对诱导后的神经样细胞进行检测，结果提示诱导后获得的神经样细胞除呈现神经细胞结构、形态外，还可进行神经细胞相关标志物表达，但是其中仍保留有牙龈成纤维细胞的免疫特征。因细胞移植的关键在于细胞功能，在对其诱导后神经样细胞结构、形态及蛋白表达情况进行分析后，本研究对其细胞功能进行了进一步分析。有报道指出，帕金森综合征、阿尔茨海默病等神经元退变类疾病的发病与多巴胺能神经元及胆碱能神经元的变性有关〔13〕。有研究指出，可对胚胎干细胞进行诱导培养，使其分化为神经细胞，并且诱导后的细胞可产生乙酰胆碱等神经递质〔14〕。有学者提出，在去甲肾上腺素的交感神经元中可同时存在去甲肾上腺素及乙酰胆碱〔15〕。近几年，多种生物化学技术逐渐应用，越来越多的研究证实，在一个神经元中可共存由两种或以上几种神经递质。本研究结果说明，将牙龈成纤维细胞诱导分化成的神经样细胞不仅具有神经细胞结构、形态，还同样具有神经细胞分泌功能，可分泌相关神经递质，行驶神经细胞的功能。本研究初步证实，可由牙龈成纤维细胞诱导分化成为神经样细胞，但是对于其是否满足临床移植需求还需进行进一步研究证实。

综上，对牙龈成纤维细胞进行诱导处理可获得神经样细胞，诱导后细胞不仅具有神经细胞结构、形态，同样具有神经细胞的分泌功能，分泌大量的乙酰胆碱及多巴胺等神经递质。