大黄素对慢性牙周炎大鼠牙槽骨重建、炎症反应及RANKL/OPG蛋白表达的影响

姜丽媛

(安徽医学高等专科学校口腔医学院，安徽 合肥 230601)

慢性牙周炎可导致牙周支持组织受损，进而引发牙齿松动脱落或拔除，是口腔常见慢性感染性疾病[1]。一项调查显示，世界范围内约10%的人群患有重度牙周炎[2]。研究显示，慢性牙周炎不仅可导致牙周组织受损，亦与糖尿病、心血管疾病等形成及进展联系紧密，给患者带来严重影响[3]。现阶段临床主要通过清除菌斑及牙石、消除牙龈炎症对慢性牙周炎患者进行干预，然而其清除牙菌斑的效果并不理想，尤其是对重度牙周炎患者[4-5]。故进一步寻求慢性牙周炎有效的治疗手段尤为重要。大黄素可发挥抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等功效，其已广泛应用于各种炎症性疾病治疗[6-7]。有报道显示，大黄素可抑制炎性因子表达，进而发挥治疗牙周炎的作用。核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL) /骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是骨代谢过程中极为重要的途径，研究证实，炎性因子可导致其比例失调，最终引发牙槽骨吸收[8]。基于上述背景，本研究旨在探究大黄素对慢性牙周炎大鼠牙槽骨重建、炎症反应及RANKL/OPG蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 48只SD大鼠购于凯学生物科技(上海)有限公司，生产许可证号：SCXK(沪)2019-0001，体质量(280±20) g。将所有大鼠饲养于SPF级动物房，均自由摄食及饮水，自动控制昼夜循环，每12 h更换1次。

1.2 主要试剂 大黄素(批号：110756-201913，北京普非生物科技有限公司)；苏木素(批号：CTS-1097，上海晅科生物科技有限公司)；伊红(批号：C200201，武汉华美生物工程有限公司)；RIPA(批号：R1001221，武汉博欧特生物科技有限公司)；BCA蛋白检测试剂盒[批号：P0012，伊势久(江苏连云港)生物科技有限责任公司]；RANKL抗体(批号：bs-0747R-1，上海恒斐生物科技有限公司)；OPG抗体(批号：ab73400，上海西格生物科技有限公司)；β-actin抗体(批号：AF7018，武汉时胜生物科技有限公司)；ELISA试剂盒(批号：I1FE1021bm，上海威奥生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 分组 随机抽取12只大鼠作为NC组，余36只大鼠通过探针分离其右侧上颌第二磨牙牙龈 。随后通过无菌医用丝线于牙周进行结扎，最后将丝线放在牙龈下，并进行高糖饮食，连续2个月。建模成功后将牙周炎大鼠随机分为模型组、大黄素低剂量组、大黄素高剂量组，每组12只，其中大黄素低、高剂量组分别予以200 mg/kg、400 mg/kg大黄素灌胃，NC组、模型组均予以等量生理盐水灌胃，每日1次。各组大鼠均连续灌胃4周。大黄素给药剂量参考相关文献[9]。

1.3.2 HE染色观察牙周组织形态变化 将大鼠断颈处死，并分离其右侧上颌骨第二磨牙牙周组织，约剪取0.5 g，将其置于4%多聚甲醛固定，石蜡包埋切片；经60 ℃烤片处理后通过二甲苯脱蜡，然后将其置于梯度酒精(75%、85%、95%、100%)浸泡。从酒精中取出切片并通过0.5%苏木素染色，10 min后取出并通过流水冲洗3次；将切片放入1%盐酸酒精中10 s，取出再次流水冲洗3次；滴加氨水并经流水冲洗3次；经伊红染色、梯度酒精脱水、二甲苯透明后封片并进行观察。

1.3.3 Micro-CT分析 骨组织重建通过Micro-CT对大鼠牙槽骨标本进行扫描，重构大鼠牙槽骨结构图，相关计量指标包括骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目、骨小梁分离度。

1.3.4 ELISA法检测牙周组织白介素-17(Interleukin-17，IL-17)、白介素-23(Interleukin-23，IL-23)水平 取0.1 g大鼠牙周组织制备组织匀浆，以3000 r/min的速度离心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱中等待检测。稀释提前制备好的样品及对照品，加入50 μL检测抗体后封板，轻轻震荡后于37 ℃环境下孵育1 h。然后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，封板后轻轻震荡，于室温下培养45 min。将底物A、B置于其中，随后放在37 ℃环境下避光反应15 min，加入终止液终止显色反应，通过酶标仪于450 nm波长处测定吸光度。

1.3.5 Western Blot检测 牙周组织RANKL、OPG表达取牙周组织通过RIPA裂解，经离心机以2000 r/min的速度离心10 min后取上清液，并进一步通过BCA法测定蛋白浓度。将30 μg蛋白样品置于各个通道，经SDS-PAGE分离蛋白质并进一步转至PVDF膜，电转完成后采用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭处理1 h，加一抗并于4 ℃环境下过夜； 加二抗置于室温下孵育1 h，随后于曝光仪中曝光处理，经Image J分析RANKL、OPG目标蛋白表达量，以β-actin作为内参。

2 结果

2.1 各组牙周组织形态变化分析 NC组牙周组织未发生明显变化；模型组出现牙龈上皮增生，且有牙周袋形成，可见明显炎症细胞浸润及破骨细胞形成；大黄素低、高剂量组牙龈上皮增生、破骨细胞数量均少于模型组，且有少量炎症细胞浸润，可见成骨细胞及类骨质形成。见图1。

图1 各组牙周组织形态变化(HE染色，×400)

2.2 各组Micro-CT相关指标对比结果 模型组骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目均较NC组降低，骨小梁分离度较NC组升高(P<0.05)。大黄素低、高剂量组骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目均较模型组升高，骨小梁分离度均较模型组降低(P<0.05)。大黄素高剂量组骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目均较大黄素低剂量组升高，骨小梁分离度较大黄素低剂量组降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组Micro-CT相关指标对比

2.3 各组炎性因子水平对比 模型组IL-17、IL-23水平均较NC组上调(P<0.05)。大黄素低、高剂量组IL-17、IL-23水平均较模型组下调(P<0.05)。大黄素高剂量组IL-17、IL-23水平均较大黄素低剂量组下调(P<0.05)。见表2。

表2 各组炎性因子水平对比 单位：ng/L

2.4 各组牙周组织RANKL、OPG蛋白表达对比结果 模型组组织中RANKL蛋白表达较NC组上调，OPG蛋白表达较NC组下调(P<0.05)。大黄素低、高剂量组组织中RANKL蛋白表达均较模型组下调，OPG蛋白表达均较模型组上调(P<0.05)。大黄素高剂量组组织中RANKL蛋白表达较大黄素低剂量组下调，OPG蛋白表达较大黄素低剂量组上调(P<0.05)。见表3、图2。

表3 各组牙周组织RANKL、OPG蛋白表达对比结果

3 讨论

大黄素可发挥抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等功效，研究证实其可下调PLA2及5-LOX表达，进而导致LTs、TXB等因子分泌明显降低，有利于抑制炎症细胞浸润[6，10]。张国华等[6]表明，大黄素可对实验性大鼠牙周炎模型发挥保护作用，其作用机制可能是通过抑制牙周组织中核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族热蛋白结构域3炎症小体通路进而抑制IL-2、IL-6等炎性因子表达实现的。徐梅等[11]通过建立慢性牙周炎大鼠模型并予以大黄素干预，发现经大黄素干预后其牙周膜细胞增殖明显加快，有利于增强细胞活性，同时亦可下调炎性因子表达。

图2 各组牙周组织RANKL、OPG蛋白表达对比

组织病理观察是研究中常用方式之一，通过该方式可对牙周炎组织炎症细胞浸润、牙槽骨吸收、破骨细胞形成等情况进行分析，本研究通过HE染色对慢性牙周炎大鼠及正常大鼠牙周组织形态变化进行观察，结果显示，模型组出现牙龈上皮增生，且有牙周袋形成，可见明显炎症细胞浸润及破骨细胞形成；大黄素低、高剂量组牙龈上皮增生、破骨细胞数量均少于模型组，且有少量炎症细胞浸润，可见成骨细胞及类骨质形成。牙槽骨细胞破坏可作为牙周炎的临床症状之一，CT三维重建测量法是当下临床判断骨结构的常用手段之一[12-13]。其中Micro-CT具有操作简便、可重复性强、无创、精确等优势，其可对骨小梁进行精确扫描并实施3D重建，进而对骨组织质量进行分析[14-15]。本研究结果显示，模型组骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目均较NC组降低，骨小梁分离度较NC组升高。大黄素低、高剂量组骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数目均较模型组升高，骨小梁分离度均较模型组降低，尤以高剂量组变化最为明显。说明大黄素可促进慢性牙周炎大鼠牙槽骨重建。

炎症反应及免疫反应在慢性牙周炎牙周组织破坏和修复过程中扮演关键角色[16-17]。IL-23可参与抑制牙周膜纤维细胞转化，同时亦可导致牙槽骨吸收破坏，研究证实其在慢性牙周炎患者龈沟液中的表达较健康对照组显著增加，且其表达与患者牙周组织破坏程度及炎症反应程度密切相关[18-19]。BUNTE K等[20]、王中秀等[21]研究表明，在牙周炎形成及进展过程中伴随着IL-17表达增强，此时Th17介导的细胞免疫应答亦随之增强。本研究结果显示，模型组IL-17、IL-23水平均较NC组上调，说明慢性牙周炎大鼠体内炎性因子水平上调。既往报道表明，IL-17水平和牙槽骨吸收受损密不可分，IL-17A及辅助性T17细胞是牙槽骨吸收受损过程中极为关键的因素[16，22]。大黄素低、高剂量组IL-17、IL-23水平均较模型组下调，尤其是高剂量组下调更为明显，说明大黄素可明显减少慢性牙周炎大鼠体内炎性因子水平。

RANKL及OPG可参与调控牙周炎牙槽骨吸收过程并发挥重要作用，在正常生理情况下，前者表达较后者明显减弱，此时破骨细胞形成明显减少，牙周内环境处于相对稳定的状态[8]。刘勇刚等[8]、BALLI U等[23]报道显示，牙周炎患者龈沟液RANKL表达较健康对照组明显上调，OPG表达较健康对照组明显减少，患者牙周局部微环境内两者处于失衡状态，破骨细胞产生增加，进而导致牙槽骨吸收过度，给骨密度及骨吸收带来不良影响。本研究结果显示，模型组组织中RANKL蛋白表达较NC组上调，OPG蛋白表达较NC组下调。大黄素低、高剂量组组织中RANKL蛋白表达均较模型组下调，OPG蛋白表达均较模型组上调，尤以大黄素高剂量组变化最明显。 说明大黄素可能是通过上调OPG表达，下调RANKL及IL-17、IL-23表达而延缓牙周组织破坏，进而发挥促进牙槽骨改建作用。大黄素可上调OPG表达，下调RANKL表达，并抑制慢性牙周炎大鼠牙周组织炎症反应，有利于促进其牙槽骨重建。