激动ALDH2抑制程序性坏死减轻脓毒症小鼠心肌损伤的作用探讨

张共鹏，魏艳龙，黄毓慧，李文韬，程志鹏，高琴，王佳慧，叶红伟

(1. 蚌埠医学院临床医学院，安徽 蚌埠 233000；2. 蚌埠医学院生理学教研室，安徽 蚌埠 233000；3. 蚌埠医学院解剖学教研室，安徽 蚌埠 233000)

脓毒症是指机体对感染的反应失调导致的多器官功能障碍[1]，脓毒症心肌损伤是最常见的器官功能障碍之一[2]，其增加了脓毒症患者的死亡率，因此寻找有效的预防和治疗方法具有重要意义。本课题组前期已报道程序性坏死(necroptosis)参与高糖诱导的心肌细胞损伤[3-4]，程序性坏死亦参与脓毒症诱导的肝、肾损伤[5-6]，但在脓毒症心肌损伤中的报道较少。线粒体乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2)作为一种重要的抗氧化酶参与对抗多种疾病损伤[7]。本课题组前期研究显示高表达ALDH2可减轻高糖诱导的心肌程序性坏死和炎症反应，发挥保护作用[3-4，8]，另有报道显示ALDH2可减轻内毒素诱导的心肌功能障碍[9]。那么，激动ALDH2是否减轻脓毒症心肌损伤中程序性坏死的发生？因此，本研究通过盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture，CLP)诱导小鼠脓毒症心肌损伤，首先观察程序性坏死是否参与心肌损伤，进一步通过Alda-1特异性激动ALDH2，分析其是否通过抑制程序性坏死发挥保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司)；BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；兔抗小鼠RIPK1、RIPK3抗体(上海爱必信生物科技有限公司)；兔抗小鼠ALDH2抗体(Abcam公司，英国)、兔抗小鼠Caspase-8抗体(Affinity公司，美国)、兔抗小鼠GAPDH抗体(上海爱必信生物科技有限公司)；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(北京兰杰柯科技有限公司)。

1.2 实验动物 8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠30只(体质量18～22 g)(河南斯克贝斯生物科技股份有限公司)。本研究经动物伦理委员会许可，动物的护理和处理严格遵守《实验动物管理条例》进行，所有动物都于蚌埠医学院动物实验中心饲养。

1.3 实验分组及CLP脓毒症模型建立 小鼠随机分为3组，10只/组。各组小鼠手术前12 h禁食，自由饮水。4%异氟烷诱导麻醉，掐尾反应评估小鼠达到稳定麻醉后，1%异氟烷维持麻醉状态至CLP手术结束。CLP模型小鼠使用手术剪在腹白线处逐层剪开表皮、肌层和腹膜(切口长度约1～2 cm)，分离盲肠，于盲肠长度1/2或3/4的位置用4号无蒂丝线进行环形结扎。随后在盲肠末端以上约0.5 cm处采用针头扎穿两次，挤出内容物少许，将盲肠复位，逐层缝合肌肉及皮肤，术后立即给予2 mL/100 g生理盐水补充体液。假手术(Sham)组小鼠除盲肠不结扎穿孔外，其余操作同CLP组。CLP+Alda-1组小鼠在进行CLP术前1 h腹腔注射ALDH2特异性激动剂Alda-1(10 mg/kg)[10-12]，其余操作同CLP组。

1.4 HE染色观察心肌形态变化 小鼠造模后24 h，麻醉后取新鲜心肌组织，PBS溶液清洗，4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，随后切片(0.5 mm)，采用苏木精-伊红(HE)染色，于光镜下(Nikon Eclipse E100)观察小鼠心肌组织结构变化。

1.5 透射电子显微镜观察心肌超微结构变化 小鼠造模后24 h，立即取心尖组织(约1 mm3)，置入2.5%戊二醛电镜固定液中，后在1%锇酸避光室温固定2 h，脱水、渗透包埋、聚合后超薄切片(70 nm)染色，在透射电子显微镜(HITACHI，HT7800，日本)下观察小鼠心肌超微结构的变化。

1.6 ELISA法检测各组小鼠心肌组织TNF-α含量变化 造模后24 h，提取小鼠心肌组织，12 000 r/min 4 ℃低温离心15 min，取上清液，每组吸取50 μL上清液，按照试剂盒说明步骤操作，最后测量各孔吸光度(A)，计算各组心肌组织TNF-α含量。

1.7 Western Blot检测心肌组织ALDH2、Caspase-8、RIPK1和RIPK3的蛋白表达 每只小鼠取约50 mg心肌组织，加入10 μL/mg RIPA裂解液和0.1 μL/mg PMSF蛋白酶抑制剂置于冰上裂解30 min后提取组织总蛋白，BCA法测定各组蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液，定量30 μg上样，电泳(30 min)后将蛋白转至PVDF膜(2 h)，5%脱脂牛奶封闭(2 h)，兔抗小鼠ALDH2抗体(1∶2000)、Caspase-8抗体(1∶2000)、RIPK1抗体(1∶500)、RIPK3抗体(1∶500)和GAPDH抗体(1∶6000)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，兔抗山羊二抗(1∶8000)孵育2 h，TBST洗膜3次，采用化学发光成像系统(FluorChem M，美国)曝光、显影。Image J软件分析各组不同蛋白表达水平。

2 结果

2.1 各组小鼠心肌组织形态与超微结构变化 HE染色和电镜结果显示，Sham组心肌纤维细胞排列整齐，形态完整，无坏死和炎症细胞浸润(见图1)，线粒体排列整齐，膜完整(见图2)。CLP组心肌细胞排列紊乱，间质水肿，心肌纤维断裂，排列紊乱，伴有炎症细胞浸润(见图1)，部分线粒体肿胀变性，嵴断裂，外膜部分溶解消失，结构不完整(见图2)。CLP+Alda-1组肌丝排列较整齐，部分炎症细胞浸润(见图1)，线粒体损伤减轻，膜较完整，部分线粒体出现嵴断裂和肿胀(见图2)。

注：黑色箭头标记炎症细胞，红色箭头标记红细胞渗出。图1 各组小鼠心肌组织HE染色(×400)

图2 各组小鼠心肌组织透射电镜图片(×15000)

2.2 各组小鼠心肌组织TNF-α含量变化 与Sham组相比，CLP组心肌组织TNF-α含量升高(P<0.01)。与CLP组相比，CLP+Alda-1组心肌组织TNF-α含量降低(P<0.05)。见图3。

2.3 各组小鼠心肌组织ALDH2、Caspase-8、RIPK1和RIPK3蛋白表达变化 Western Blot检测各组ALDH2、Caspase-8、RIPK1和RIPK3蛋白表达，代表性条带见图4A。与Sham组相比，CLP组心肌ALDH2蛋白表达降低(P>0.05)，见图4B。Caspase-8蛋白表达降低(P<0.05)，见图4C。RIPK1、RIPK3蛋白表达增加(P<0.01)，见图4D、图4E。与CLP组相比，CLP+Alda-1组ALDH2和Caspase-8蛋白表达增加(P<0.05)，见图4B、图4C，RIPK1和RIPK3蛋白表达降低(P<0.01或P<0.05)，见图4D、图4E。

注：与Sham组相比，**P< 0.01； 与CLP组相比，#P< 0.05。图3 各组小鼠TNF-α含量的变化

注：各组小鼠心肌组织中代表性的Western Blot条带(A)，ALDH2(B)、Caspase-8(C)、RIPK1(D)和RIPK3(E) 蛋白表达的变化。与Sham组相比，*P<0.05，**P<0.01；与CLP组相比，#P<0.05，##P<0.01。图4 各组小鼠心肌组织的Western Blot结果

3 讨论

程序性坏死(necroptosis)是一种不同于凋亡及传统坏死的促炎细胞死亡方式，属于可调节性细胞死亡[13]，受多种蛋白质或激酶的调控，RIPK1(Receptor Interacting Protein Kinase 1)-RIPK3(Receptor Interacting Protein Kinase 3)-MLKL(Mixed Lineage Kinase Domain like protein)是介导程序性坏死发生的经典通路[14]。程序性坏死可以被激活凋亡的相同死亡配体刺激，其中TNF-α是被研究得最充分的一种，其可以被TNFR1识别，并与泛素化的RIPK1形成复合物Ⅰ[15]，当Caspase-8缺乏或被抑制时，RIPK1与RIPK3结合，通过分子内自磷酸化和反式磷酸化形成RIPK1/RIPK3。RIPK3聚集并磷酸化MLKL形成复合物Ⅱc，磷酸化的MLKL从细胞溶质转移到质膜和细胞内膜，MLKL寡聚化导致膜孔形成、膜破裂并最终引起程序性坏死[14]。

程序性坏死参与多种疾病的发生，其在脓毒症心肌损伤中作用如何？本研究采用使用最广泛的脓毒症动物模型——CLP法诱导小鼠脓毒症心肌损伤。观察CLP后24 h小鼠心肌结构变化[16-19]。结果显示，与Sham组相比，CLP干预24 h后小鼠心肌纤维排列紊乱、断裂、间质水肿，且有炎症细胞浸润；心肌线粒体肿胀、嵴断裂，提示脓毒症可诱导心肌细胞及线粒体损伤。已有研究发现脓毒症心肌损伤的发生与炎症因子风暴进一步激活相关信号通路相关，其中TNF-α发挥重要作用[20]。降低TNF-α的含量可减轻脓毒症心肌损伤[21]。TNF-α还可以诱导程序性坏死的发生。因此本研究检测了脓毒症小鼠心肌TNF-α含量，结果显示与Sham组相比，CLP组心肌TNF-α的含量显著增加。TNF-α可诱导程序性坏死的发生，那么脓毒症心肌损伤中是否有程序性坏死的发生？本研究进一步检测了与程序性坏死密切相关的RIPK1、RIPK3和Caspase-8蛋白表达，结果显示，与Sham组相比，CLP组RIPK1、RIPK3蛋白表达增高，Caspase-8蛋白表达降低，提示程序性坏死参与脓毒症诱导的心肌损伤。

线粒体是调节程序性坏死[22]、细胞凋亡[23]等不同细胞死亡的关键。线粒体损伤可能是脓毒症心肌损伤中的关键因素[24]，减轻线粒体功能障碍对于维持心肌正常功能活动至关重要，并且可能为脓毒性心肌病提供可行的保护措施[25]。促进线粒体关键酶——ALDH2的表达可减轻线粒体损伤，保护心肌、肝脏和神经细胞等免受损伤[26-29]。SHEN C等[30]已报道ALDH2缺乏时，小鼠心肌细胞发生RIPK1/RIPK3/MLKL介导的程序性坏死。本研究结果显示CLP组心肌细胞线粒体损伤；基于线粒体及ALDH2在心肌损伤中的作用，给予Alda-1激动ALDH2表达分析心肌损伤改变。结果显示，虽然与Sham组相比，CLP组心肌ALDH2蛋白表达降低不显著，但给予Alda-1干预后，与CLP组相比，CLP+Alda-1组心肌ALDH2蛋白表达增加，心肌形态和线粒体结构有所改善，TNF-α含量降低，程序性坏死通路中的关键蛋白RIPK1、RIPK3表达降低，Caspase-8蛋白表达增加，提示激动ALDH2可通过减少TNF-α的释放、抑制程序性坏死，以减轻脓毒症心肌损伤，ALDH2如何调控程序性坏死还有待进一步深入探讨。

综上所述，程序性坏死参与脓毒症诱导的心肌损伤、激动ALDH2发挥心肌保护作用可能与抑制程序性坏死有关。