基于ZnSe-碳量子点荧光共振能量转移体系检测盐酸强力霉素

刘长青， 廖楚健， 周素莲， 易忠胜， 陶慧林

(1.青海省有色第一地质勘察院，青海西宁 810006；2.桂林市恭城瑶族自治县妇幼保健院，广西桂林 542500；3.桂林理工大学南宁分校，广西南宁 530001；4.桂林理工大学化学与生物工程学院，广西桂林 541004)

盐酸强力霉素(Doxycycline hyclate,DOX)是四环素族半合成抗生素，主要用作抗革兰氏阳性及阴性菌感染，不仅抗菌作用强，而且对四环素等耐药的金黄色葡萄球菌有效，国内外应用较广[1]。大量的盐酸强力霉素排放到环境中，从而对生态系统和人体造成危害[2]。因此，有必要对DOX残留进行监控。目前，文献报道测定DOX的方法主要有比色法[3]、电化学法[1,4]、毛细管电泳法[5]、高效液相色谱法[6]、荧光光谱法[7,8]等。但这些方法成本较高，且需要复杂的样品前处理和繁琐的检测步骤。因此，研究建立快速、准确的DOX分析技术，具有重要的科学意义。荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)是指一个荧光基团(供体，Donor)的发射光谱与另一个基团(受体，Acceptor)的吸收光谱有一定范围的重叠，分子间的距离小于10 nm时，受体分子吸收来自供体分子能量的现象，是一种非辐射跃迁[9,10]。

近几年来，具有优良光学特性量子点已逐步代替传统染料用来建立荧光共振能量转移体系。目前，在各类物质分析检测上有很大的发展[11 - 13]。但是常用的半导体量子点多含有Cd、Pb、S等具有较强环境和生物毒性的元素，危害较大。虽然Zn也是一种重金属，但其毒性远远小于Cd和Pb，且Zn和Se都是生物体必须的微量元素。而大量研究表明，CQDs生物、环境毒性很小。ZnSe量子点作为供体，CQDs作为受体建立的FRET体系用于检测DOX的研究目前国内外尚未见报道。本文提出使用的ZnSe量子点为荧光供体，CQDs为受体构建FRET体系，在充分利用量子点所拥有的优势的同时，又大大降低了量子点中毒性元素对环境造成的危害。最终基于该体系建立一个操作方便，设备简单，灵敏度高且对环境友好的测定DOX的新方法。

1 实验部分

1.1 仪器及试剂

RF-5301PC荧光光度计(日本岛津)；TU-1901紫外可见分光光度计(北京仪器公司)；电子分析天平FA1244(中国江苏仪器厂)；精密pH计(上海仪器厂)；JEM-1400型透射电子显微镜(TEM，日本电子)。

硒粉(AR，麦克林)；谷胱甘肽(BR，源叶生物)。三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl，pH=7.2)；盐酸强力霉素(DOX)标准溶液；实验所用试剂均为分析纯，所有用水均为二次蒸馏水。

1.2 实验方法

1.2.1 ZnSe量子点的制备参照文献方法[14]并作适当修改，首先称取硒粉0.0078 g，硼氢化钠0.0140 g加入细口瓶中，再加入300 μL二次水，冰浴40 min至硒粉完全溶解，得到无色透明的NaHSe溶液，备用。另取一个洁净的三口烧瓶，加入0.0880 g乙酸锌、0.1200 g谷胱甘肽和100 mL二次水，使用1 mol/L的NaOH调节至pH=11。在强磁力搅拌下，继续通氮气除氧20 min，随后迅速加入备用的NaHSe溶液，继续在氮气的保护下，于95 ℃下连续搅拌回流1.5 h，即可获得无色透明的ZnSe水溶性量子点溶液，并于4 ℃冰箱中保存，待用。

1.2.2 CQDs的制备按文献方法[15]并作适当修改，在反应釜的聚四氟乙烯内衬中依次加入柠檬酸钠盐0.20 g、碳酸氢铵1.50 g及10 mL蒸馏水，置于180 ℃鼓风干燥箱中反应4 h，冷却至室温。将反应后的溶液装入100 mL的容量瓶中，稀释至刻度，置于避光冰箱中保存备用。

1.2.3 DOX测定方法在一系列5 mL比色管中加入一定量的ZnSe、CQDs、DOX溶液，加入pH=7.2的Tris-HCl缓冲液1.50 mL，再用二次水定容至刻度，混匀，在25 ℃下放置反应5 min后，于λex=340 nm下测定相应荧光强度I。

2 结果与讨论

2.1 ZnSe与CQDs的表征及量子产率

图1(a)和1(b)分别为ZnSe量子点和CQDs的TEM图，由图1(a)和1(b)可知，所合成的两种量子点呈准球形分布、分散性较好，粒子尺寸分布较为集中，粒径大小主要集中在3 nm到5 nm之间。

图1 ZnSe量子点(a)与CQDs(b)的TEM图Fig.1 TEM images of ZnSe(a) and CQDs(b)

采用参比法测定供体与受体的荧光量子产率Φ[16]。计算公式如下：

(1)

式中，Φu、Φs为待测物和参比标准物的荧光量子产率；Fu、Fs为待测物和参比物的积分荧光强度；Au、As为待测物和参比标准物的吸光度。

本文采用硫酸奎宁溶液作为荧光参比物质。根据文献报道[18]硫酸奎宁量子产率为0.55，据此测得ZnSe量子产率为0.21，CQDs量子产率为0.65。

2.2 ZnSe-CQDs能量转移体系的构建

供体的发射光谱和受体吸收光谱有一定程度的重叠是其分子间发生能量转移的条件之一[10,17]。因此对ZnSe量子点的荧光光谱和CQDs的吸收光谱进行分析(图2)。由图2(a)可知，ZnSe量子点的荧光峰在380 nm左右(曲线2)，CQDs的吸收峰在340 nm左右(曲线1)，两者差为40 nm，有良好的光谱重叠，为发生能量转移提供了前提条件。其中ZnSe量子点作为能量供体，而CQDs为能量受体。

为了保证能量转移效果，采用340 nm作为激发波长，这样CQDs能够被充分激发，而ZnSe量子点被激发的荧光峰较弱，这样就能很好地验证能量转移现象。结果如图2(b)所示，体系中荧光供体ZnSe在380 nm处的荧光发生猝灭，将能量有效地转移给受体CQDs，使CQDs在450 nm处的荧光显著增强，说明在ZnSe-CQDs之间发生了明显的荧光共振能量转移。

为了进一步确定ZnSe-CQDs之间的FRET现象，测试了加入受体(CQDs)前后供体(ZnSe)荧光寿命的变化。如图2(c)所示，供体的荧光寿命为6.65 ns，加入受体后其荧光寿命衰减为5.03 ns，加入受体后供体的荧光寿命发生了明显变化。荧光寿命的测试结果再次证实了ZnSe-CQDs之间发生了荧光共振能量转移。

图2 (a) CQDs的吸收光谱(1)和ZnSe量子点的荧光光谱(2)；(b) ZnSe量子点(1),CQDs(2)和ZnSe-CQDs(3)的荧光发射光谱；(c)加入受体前(1)后(2)供体的荧光寿命衰减曲线。Fig.2 (a)Absorption spectrum of CQDs(1) and fluorescence spectrum of ZnSe(2);(b)Fluorescence spectra of ZnSe(1),CQDs(2) and the mixture of ZnSe-CQDs(3)；(c)Time-resolved decays of the donor before(1) and after(2) the addition of the acceptor.ρ(ZnSe)=15.00 μg/mL,ρ(CQDs)=1.50 μg /mL.

2.3 能量转移相关参数的测定

根据Förster非辐射能量转移机制可知，影响能量转移效率的主要因素是供体-受体之间的距离(r)与临界能量转移距离(R0)。供体与受体之间能量转移满足下面关系[18]：

(2)

(3)

(4)

式中K2为偶极空间取向因子(K2=2/3)，N为水的折射率(N=1.33)，Φ为供体的荧光量子产率(Φ=0.51)，J为供体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱之间的光谱重叠积分。本实验计算得到R0=2.54 nm，r=2.79 nm，J=4.3×10-15J/(cm3·L·moL-1)，说明ZnSe与CQDs能很好地结合，E=0.36，说明该体系具有较高的荧光共振能量转移效率。

2.4 DOX对ZnSe-CQDs体系的荧光猝灭作用

图3展示了ZnSe-CQDs体系对DOX的检测原理。由图3可知，DOX对ZnSe和CQDs均有猝灭。ZnSe与CQDs间的FRET现象导致ZnSe的荧光降低，CQDs的荧光增强，而DOX的加入则使得体系的荧光发生有效猝灭，根据两个荧光团之间的荧光猝灭比率(I380/I450)与DOX浓度间的线性关系可实现DOX的检测。

分别考察了DOX对ZnSe、CQDs、ZnSe-CQDs体系荧光强度的影响。ZnSe、CQDs、ZnSe-CQDs对DOX的响应范围分别为0.025～3.20 μg/mL、0.20～12.80 μg/mL、和0.025～12.80 μg/mL。当DOX的浓度为0.80 μg/mL时，ZnSe的荧光被猝灭了60%左右，CQDs的荧光被猝灭了30%，而ZnSe-CQDs体系中ZnSe和CQDs的荧光分别被猝灭了80%和40%左右。实验结果表明，FRET的荧光放大作用赋予了体系更高的灵敏度和更宽的线性范围。此外，FRET体系的构建成功引入了两个荧光团，为比率型荧光传感器的构建提供了良好的前提条件。而比率型荧光传感器具有自我校正功能，可以提高方法的准确度[19]。

为获得最佳的实验效果，考察了不同温度、pH值、缓冲溶液以及表面活性剂对ZnSe-CQDs体系的影响。结果表明，在25 ℃下，pH为7.2的Tris-HCl缓冲溶液中DOX对ZnSe-CQDs荧光猝灭效果最佳。此时，5 min内DOX与ZnSe-CQDs即可反应完全，而且60 min内基本稳定。

图3 ZnSe-CQDs体系对DOX的检测原理Fig.3 Schemeatic display of the DOX detection via ZnSe-CQDs system

2.5 ZnSe-CQDs体系对DOX的检测机理

采用Stern-Volmer方程考察了DOX对ZnSe-CQDs体系的荧光猝灭机理。一般而言，猝灭剂对荧光团的猝灭行为可分为静态猝灭和动态猝灭[20]。静态猝灭为猝灭剂和荧光团作用形成新的络合物导致荧光猝灭，其猝灭常数(Ksv)随着温度的升高而降低；动态猝灭为猝灭剂和荧光团相互碰撞而导致荧光猝灭，其Ksv随着温度的升高而升高。考察了288 K、298 K、308 K时DOX对ZnSe-CQDs体系中ZnSe和CQDs的荧光猝灭情况，结果如图4(a)、图4(b)所示。根据图4(a)，288 K、298 K、308 K时DOX对ZnSe的Ksv分别为：2.1×107、1.9×107、1.6×107L/mol；而根据图4(b)，在这三个温度下DOX对CQDs的Ksv分别为：5.1×107、4.5×107、3.9×107L/mol。可见，DOX对ZnSe和CQDs的猝灭的Ksv都是随着温度的升高而降低，属于静态猝灭。因此，DOX对ZnSe-CQDs的荧光猝灭可归属为DOX与ZnSe、CQDs上的羟基、羧基等官能团发生反应，生成无荧光的基态化合物而导致体系的荧光猝灭。

图4 不同温度下DOX对ZnSe(a)和CQDs(b)的Stern-Volmer猝灭曲线Fig.4 Stern-volmer curves of DOX to ZnSe(a) and CQDs(b) under different temperatures c(DOX):0.00,0.10,0.20,0.40,0.60,0.80 μmol/L;ρ(ZnSe)=20.00 μg/mL,ρ(CQDs)=2.00 μg /mL.

2.6 干扰实验

2.7 工作曲线

图5 工作曲线Fig.5 Calibration curveρ(ZnSe)=20 μg/mL,ρ(CQDs)=2.0 μg/mL,ρ(DOX):0.00,0.025,0.050,0.10,0.20,0.40,0.80,1.60,3.20,6.40,10.00 μg/mL.

在最佳实验条件下，以FRET体系中450 nm处CQDs荧光团的荧光强度(I450)与380 nm处ZnSe荧光团的荧光强度(I380)比值(I450/I380)为Y轴，以DOX浓度为X轴，绘制工作曲线，结果如图5所示。实验结果表明，DOX浓度在0.025 μg/mL～10.00 μg/mL范围内，I450/I380值与浓度呈良好的线性关系，线性回归方程为I450/I380=3.68ρ+2.88，线性相关系数为r=0.9987，用3σ/k计算该方法的检出限为7.51 ng/mL(n=11)。将本方法的线性范围、检出限与已发表的其他方法对比如表1所示。陶慧林等人[7]基于甲基红和CdTe量子点之间的FRET现象建立了DOX的检测方法，取得了良好的检测效果。但是体系涉及到的甲基红和CdTe都具有环境毒性，且该体系只是基于单一的荧光信号识别DOX，容易受环境的影响。而与甲基红、CdTe相比，本研究涉及的CQDs和ZnSe更加绿色环保，采用双荧光信号识别DOX，建立比率型荧光探针检测DOX方法，可靠性更好，准确度更高。

表1 本方法与其他不同检测方法在DOX分析中的性能对比

2.8 实际样品检测

采取健康新鲜尿液约20 mL于小烧杯中，静置0.5 h后，取上清液5.00 mL装入离心分离试管中，离心分离0.5 h，按实验方法测定DOX的含量。结果如表2所示，方法的回收率在98.00%～106.3%之间。RSD≤6.1%(n=6)。表明所建立方法具有较高的准确度与精密度，可用于实际样品分析。

表2 尿液中DOX的测定与加标回收实验结果

3 结论

本文以ZnSe量子点为能量供体，CQDs为能量受体构建对生态环境绿色友好的ZnSe-CQDs荧光共振能量转移体系，通过系列优化实验后建立测定盐酸强力霉素的新方法。在最佳条件下，方法的线性范围为0.025～10.00 μg/mL，检出限为7.51 ng/mL。将建立的新方法用于实际样品测定时，回收率为98.00%～106.3%。方法线性范围宽、灵敏度高、准确度好，具有潜在的应用价值。