m6A修饰在骨肉瘤中分子机制的研究进展*

凌志安，梁玉婷，韦素萍，王 禹，赵劲民**

(1.广西医科大学第二附属医院，广西南宁 530007；2.广西医科大学，广西南宁 530021)

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是骨骼系统中最常见的原发性恶性肿瘤之一，起源于间叶组织，好发于儿童和青少年，具有高侵袭性与转移性且进展迅速，早期易发生肺转移，严重危害患者的生命健康[1,2]。N6-甲基腺苷(m6A)是真核生物中编码和非编码RNA中最广泛的RNA修饰形式之一。现有研究表明，m6A相关因子在骨肉瘤进程中发生了失调，且与骨肉瘤发生发展密切相关[3]。本文强调了m6A修饰在骨肉瘤发生发展与预后转归中的关系，阐述了其细胞生物学功能和分子机制，以及未来在骨肉瘤中的研究趋势和潜在的临床应用，为临床提供新的检测指标和治疗靶点。

1 m6A修饰

N6-甲基腺苷(m6A)是发生在腺苷N6位点的甲基化修饰，是真核生物mRNA中最普遍的内部修饰。m6A修饰是指在腺嘌呤核苷酸的第6位氮原子上添加或删除甲基，是mRNA分子中最丰富的表观遗传修饰之一[4]。有研究发现，m6A修饰是一种具有动态和可逆特征的表观遗传学改变[5]，可以通过多种调节蛋白来调节RNA的剪接、核输出、定位、翻译、降解和稳定性。一些研究报道了m6A修饰在人类不同肿瘤发生发展中的作用以及与细胞分化、胚胎发育、疾病发生有关的细胞生物学功能[6,7]。Zhang等[8]研究发现，与正常组织/成骨细胞相比，在骨肉瘤组织/细胞中DLGAP1-AS2和m6A甲基化水平上调，通过进一步构建风险评分预后模型，预测DLGAP1-AS2可能成为OS的预后靶向基因。

2 m6A甲基化蛋白酶

m6A修饰主要与3种类型的蛋白酶相关，即为多酶复合体，主要包括甲基化转移酶(称为“编码器”)、去甲基化转移酶(称为“消码器”)和甲基识别蛋白(称为“读码器”)[6]，三者之间存在复杂的生物学功能[9]。

第一类是m6A甲基化转移酶，其编码基因称为“Writers”，包括METTL3、METTL14、WTAP、RBM15B、KIAA1429、ZC3H13和METTL16。METTL14与METTL3形成的稳定复合物促使m6A甲基化基团编辑入RNA中[10]，在底物识别中起主要作用[11-13]。每种蛋白其生物学功能各不相同，METTL3的结构域具有催化活性，METTL14与METTL3形成异源二聚体，协同增强甲基转移酶活性[13]。WTAP被认为是一种衔接蛋白，主要功能是和METTL3-METTL14复合物相互结合，起稳定METTL3-METTL14复合物的作用[11]。RBM15B主要功能是与尿嘧啶富集区域结合，促进某些RNAs的甲基化[14]。ZC3H13主要在锚定WTAP中起着关键作用，通过将WTAP连接到mRNA结合因子Nito来增强m6A活性[15,16]。ZC3H13参与了不同类型肿瘤的发生发展过程。据报道，ZC3H13在肾透明细胞癌组织中的表达显著下调[17]，相反，与邻近黏膜相比，ZC3H13在结肠腺癌肿瘤组织中的表达显著上调[18]。此外，METTL16是最近发现的一个甲基化转移酶，能催化U6-snRNA中的m6A修饰，并参与rRNA的剪接[19]。KIAA1429是m6A甲基化酶复合物中重要的一部分，但其分子功能仍难以捉摸[20]。总之，每一个m6A甲基化转移酶对于m6A修饰是必需的，m6A甲基化转移酶和m6A去甲基化转移酶之间的相互作用决定了m6A修饰的动态和可逆调节。

第二类是m6A去甲基化转移酶，其编码基因称为“Erasers”，目前报道的有FTO和ALKBH5[21]。这类去甲基化转移酶可去除RNA中的m6A甲基化基团，从而影响肿瘤生物学过程。越来越多的研究表明，FTO和ALKBH5的功能障碍可能导致癌症发生[22-25]。FTO在乳腺癌中表达上调，可促进乳腺癌细胞增殖，同时FTO在肝细胞癌(HCC)组织中的表达也上调，这与患者预后不良有关[26]。

第三类是甲基识别蛋白，其与m6A甲基化位点结合并读取信息，进而发挥作用，其编码基因称为“Readers”，到目前为止发现的包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2等YTH家族，还有HNRNPC、HNRNPG、HNRNPA2B1和IGF2BP[27]，这些基因在维持m6A的mRNA的稳定性、代谢以及翻译等过程中发挥重要作用[28]。随着蛋白质研究的不断深入，甲基识别蛋白逐渐被发现，其功能与分子机制也在进一步完善。

3 m6A修饰在骨肉瘤中的分子作用机制

3.1 m6A修饰在骨肉瘤发生发展中的作用

OS的发病是一个多因素的复杂过程，涉及广泛的分子异常和肿瘤异质性[29]。据报道，m6A是真核细胞中含量最丰富的RNA内部修饰，m6A修饰主要通过调节相关致癌基因或抑癌基因的mRNA水平来促进或抑制肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移等，并且异常的m6A修饰可通过多个分子机制在肿瘤发生中起重要作用[30]。

目前，许多研究证实了m6A修饰调控因子对OS细胞生物学功能的影响。Yuan等[31]的研究发现，与正常成骨细胞/组织相比，骨肉瘤细胞/组织中去甲基化酶ALKBH5水平的下调与m6A甲基化水平升高有关，ALKBH5过表达可显著抑制骨肉瘤细胞的生长、迁移、侵袭和触发细胞凋亡；而沉默ALKBH5可促进骨肉瘤细胞生长、迁移和侵袭，该研究预示ALKBH5过表达可能是替代骨肉瘤治疗的一种新方法。Chen等[32]与Huang等[33]的研究也得出类似的结论，ALKBH5通过介导PVT1的m6A修饰，抑制阅读器蛋白YTHDF2在PVT1中的结合;ALKBH5介导的PVT1上调促进了体外OS细胞增殖和体内肿瘤生长;ALKBH5的过表达显著抑制了OS细胞的生长、迁移和侵袭等细胞生物学效应。Shi等[34]利用circRNA芯片检测骨肉瘤中circRNA表达的改变，结果发现骨肉瘤组织中circNRIP1的表达水平升高，通过下调circNRIP1表达水平可抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移，促进细胞的凋亡。Ling等[35]的研究表明，在OS细胞中敲除METTL3基因，导致m6A和DRG1 mRNA水平下降，沉默DRG1可降低OS细胞的活力，抑制细胞的迁移和集落形成能力，导致细胞周期阻滞在G2/M期，诱导细胞凋亡。由上述可知，DRG1在OS中具有致瘤作用，其中METTL3以m6A依赖的方式诱导DRG1在OS中的表达上调。Wang等[36]在转移性骨肉瘤的研究中发现，METTL3与TRAF6呈正相关关系，METTL3下调会导致OS细胞中TRAF6的表达下降；METTL3在OS中高表达，通过m6A修饰增强TRAF6的表达水平，从而促进OS细胞的转移。Zhou等[37]的研究表明，METTL3通过m6A修饰提高了DANCR mRNA的稳定性，促进了OS的治疗进展，说明METTL3可能是OS治疗肿瘤的新靶点。Zhou等[38]通过沉默METTL3可使OS细胞增殖、迁移以及侵袭力下降，利用细胞学功能实验证实了METTL3通过调节ATAD2在骨肉瘤生长和侵袭过程中发挥致癌基因的作用。Miao等[39]研究表明，m6A甲基转移酶METTL3通过调控LEF1的m6A水平和激活Wnt/b-连环蛋白信号通路，从而促进骨肉瘤细胞的进展。可见，通过不同的RNA m6A甲基化转移酶激活不同的上游基因、调控不同的下游靶基因，可影响骨肉瘤的发生发展进程，预示m6A修饰已成为OS发生发展过程中的一个不可或缺的因素。

3.2 m6A修饰在骨肉瘤化疗耐药中的作用

骨肉瘤目前的标准治疗包括术前化疗、术中病灶切除、术后化疗，化学药物治疗有着不可替代的作用，但如今化疗耐药是临床上骨肉瘤治疗的一大瓶颈，因此，研究骨肉瘤化疗耐药的机制对骨肉瘤的治疗有重要的意义。近期研究发现，骨肉瘤组织中TRIM7 m6A修饰缺失，METTL3和YTHDF2是参与TRIM7 m6A异常修饰的主要因素[40]，具有较高TRIM7水平的PDX小鼠和骨肉瘤细胞中易观察到化疗耐药性，此研究预示m6A在化疗耐药中发挥重要作用，有望成为肿瘤耐药治疗的新靶点。临床上常用的化疗药物阿霉素(DXR)，主要是通过诱导骨肉瘤干细胞激活Wnt/B-catenin信号通路来发挥作用[41]。Zhang等[42]研究发现，lncRNA FOXC2-AS1 m6A修饰及其反义转录本FOXC2在具有阿霉素耐药性的骨肉瘤细胞和组织中均升高，同时FOXC2通过诱导耐药相关的ABCB1基因来促进化疗耐药。以上研究结果表明，m6A与骨肉瘤的耐药机制相关，可能通过提高或降低靶基因的m6A水平影响基因的表达及激活相关信号通路，从而影响肿瘤耐药性，为降低临床骨肉瘤化疗耐药提供理论依据。

3.3 m6A修饰在骨肉瘤靶向治疗中的作用

m6A去甲基化酶主要包括FTO和ALKBH5。FTO和ALKBH5可通过影响底物m6A修饰水平激活多种信号通路以促进骨肉瘤进展，因此m6A相关蛋白的特异性抑制剂在骨肉瘤治疗中发挥重要作用。Huang等[43]的研究团队开发出两种FTO抑制剂(FB23、FB23-2)，该抑制剂能选择性地抑制人急性髓系白血病(AML)细胞中FTO的去甲基化功能，上调AML关键基因mRNA上的m6A修饰，并通过增加抑癌蛋白的丰度、降低促癌蛋白的丰度来抑制细胞增殖，从而实现抗AML肿瘤的治疗效果，提示通过分子靶向性干预m6A修饰影响基因表达可能成为抗肿瘤的研究新方向。Shan等[44]通过检测OS细胞/组织中KLF3的表达水平，发现OS细胞/组织中KLF3的mRNA水平和蛋白水平均升高，且与OS患者肿瘤TNM的分期及预后有关，同时FTO能促进OS细胞的增殖和侵袭，抑制细胞凋亡，FTO介导的KLF3 m6A修饰促进了OS进展，预示KLF3可能为OS提供治疗靶点。Chen等[45]的研究表明，m6A去甲基化酶ALKBH5介导的PVT1上调，可促进体外OS细胞增殖和体内肿瘤生长，可知PVT1可能为OS提供治疗靶点。

3.4 m6A修饰在骨肉瘤预后转归中的作用

目前，关于m6A修饰与OS预后的研究相对较少。不同的m6A修饰调控因子与OS预后的结果有所差别。Li等[46]通过公共基因组数据集和组织微阵列分析发现，METTL3、METTL14、YTHDF2的低表达以及KIAA1429、HNRNPA2B1的高表达与不良预后显著相关，且HNRNPA2B1可能是OS的独立危险因素。Zhang等[8]利用从有效治疗方法的治疗应用研究(TRAGET)中下载的数据集，通过生物信息学分析获得与OS密切相关的m6A lncRNA，构建了m6A相关的lncRNA风险评分预后模型(RP11-286E11.1、LINC01426、AC010127.3、DLGAP1-AS2、RP4-657D16.3、AC002398.11)为OS预后研究提供了理论依据。Zhang等[47]通过分析骨肉瘤患者的预后信息发现，METTL3、YTHDC1、FTO是与生存率相关的重要标志物，且与骨肉瘤的转移存在显著相关性。Zheng等[48]利用生物信息学获得骨肉瘤的保护因子AC004812.2，AC004812.2的低表达预示着总生存率较差，而AC004812.2的过表达可抑制143B细胞增殖，提高IGF2BP1和YTHDF1的表达水平，表明AC004812.2可能是m6A修饰的重要调控因子，也是骨肉瘤中很有前景的治疗靶点。

WTAP在骨肉瘤组织中高表达，是骨肉瘤总生存期的独立预后因素。有研究表明沉默的HMBOX1明显减弱了shWTAP介导的对骨肉瘤生长和转移的抑制，且WTAP/HMBOX1通过介导PI3K/AKT通路调控骨肉瘤的生长和转移，证实了WTAP介导的m6A修饰在骨肉瘤进展中的关键作用，这可能为骨肉瘤的治疗提供了新的见解[49]。另一项研究发现，YTHDF1表达水平低的患者预后较差，总生存率较低，提示YTHDF1可能与OS患者的预后不良有关[50]。随着研究的深入，研究人员还发现了有利于OS患者预后的m6A修饰调控因子。FTO是m6A去甲基化酶，可以去除m6A修饰，调节mRNA的稳定性，最终导致各种癌症发病机制的改变[51]。此外，也有研究表明，FTO是一种保护基因，FTO的高表达可以提高骨肉瘤患者的生存率，而IGF2BP2是骨肉瘤的风险基因，IGF2BP2的高表达降低了骨肉瘤患者的生存率，FTO和IGF2BP2的异常表达与骨肉瘤的进展显著相关，是能够独立预测骨肉瘤患者预后的关键因素[52]。Liu等[53]通过检测骨肉瘤组织中METTL14的表达量发现，METTL14与骨肉瘤患者的预后呈正相关，METTL14表达下调可能是骨肉瘤发生的一个潜在机制，可作为肿瘤抑制基因。

综上可知，上述m6A修饰调控因子为OS的诊断、治疗及预后转归的评估提供了新的思路，为进一步深入研究m6A修饰调控OS的发生和发展机制提供了研究方向，为OS的辅助治疗提供了新的生物标志物。

4 展望

目前，m6A在OS中的机制研究正处于发展阶段，尽管在m6A生物学领域取得了显著的进展，但仍存在许多未知数和挑战。m6A修饰就像一把“双刃剑”，可以通过不同的方式加速或抑制骨肉瘤的进展[54]。本文总结了m6A修饰在骨肉瘤发生发展、化疗耐药、靶向治疗、预后转归的分子机制方面的研究，以期为人类骨肉瘤的治疗寻找有希望的靶点。虽然m6A的相关调节因子被证实可作为OS的诊断或治疗靶点，但关于m6A的上游调控因子和下游靶点及其致癌或肿瘤抑制机制尚不清楚，仍有待进一步深入研究。因此，未来还需从以下3个方面进行突破：第一，立足OS构建m6A及其相关修饰因子的复杂调控网络模型；第二，增大临床入选样本量和筛选因子，作为早期诊断和预后的靶标因子；第三，在OS动物模型中开展与m6A相关的靶向治疗，为OS靶向治疗提供新的思路。