非洲猪瘟弱毒疫苗研究进展

李 伟

（河南省郸城县农业农村局，河南 郸城 477150）

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起的猪的一种急性、出血性传染，导致很高的发病率和致死率，是世界动物卫生组织（WHO）法定报告的动物疫病。ASFV基因组是双链DNA病毒，基因组约为170～190 kbp，编码150～200 种蛋白质[1]。1921年在肯尼亚首次发现ASF疫情，迄今已有100年的流行历史，遍及欧洲、美洲和亚洲，给全球养猪业造成巨大经济损失[2]。然而，由于ASFV复杂的免疫保护和免疫逃避机制，迄今为止还没有安全、有效的疫苗问世。随着分子生物学技术和免疫学技术的发展，ASF疫苗的研究取得重要进展，先后有灭活疫苗、重组亚单位疫苗、弱毒疫苗等不同技术路线研制的疫苗，均获得一定的免疫保护。本文基于弱毒疫苗显示的很强免疫保护能力的特点，对近年来ASF弱毒疫苗的研究进展进行综述，以期为ASF的研发提供参考。

1 ASFV自然分离株弱毒疫苗

科研人员从软蜱和慢性感染ASFV的猪中分离到一些自然弱毒的ASFV毒株，例如OUR T88/3 和NH/P68[3-4]，这两株自然分离弱毒ASFV毒株对同源毒株的免疫保护率在66%～100%不等，其保护率与攻毒毒株的特性、免疫剂量和免疫途径等不同因素有关。从完全保护的免疫数据分析，发现免疫后抗体水平和细胞毒性CD8+T 细胞在免疫保护中发挥重要作用。研究发现，自然分离弱毒株NH/P68（基因型I）能够100%保护强毒株L60（基因型I）的攻击，而且还能够抵抗Arm/07（基因型Ⅱ）的异源毒株的攻击，但是该毒株免疫后的缺点是能够引起一定的副反应。使用弱毒株OUR T88/3 疫苗进行初始免疫，再用OUR T88/1 毒株加强免疫,对Benin 97/1和Uganda 1965强毒株攻击猪的免疫保护率分别为85.7%～100%，首次证明该疫苗具有交叉保护作用，可以抵抗非同源ASFV 毒株的攻击[5]。但是，自然分离的弱毒株疫苗免疫后引起许多不良反应，例如，在用NH/P68 毒株免疫后，约25%～47% 的猪出现慢性感染的症状，接种OUR T88/3 的猪出现发烧和关节肿胀等症状[6]。Gallardo 等人[7]报道了一种（non-HAD）ASFV 基因型Ⅱ毒株，该毒株系2017 年拉脱维亚野猪中分离的病毒，命名为Lv/17/WB/Rie1。该毒株的基因组序列的特征在于EP402R基因存在单核苷酸缺失，导致该蛋白功能丧失。实验感染猪临床症状不明显，有的甚至无症状，表现为间歇性病毒血症和高抗体反应。两个月后，当这些动物暴露于感染了强毒株基因型ⅡASFV的其他动物时，这些动物没有受到病毒的感染而获得完全保护。虽然实验动物数量不多，但上述结果表明，Lv17/WB/Rie1毒株的疫苗具有成为减毒活疫苗的潜力。

2 ASFV传代弱毒疫苗

ASFV通过敏感细胞传代培养可以降低病毒致病性，常用细胞有猪肺泡巨噬细胞、Vero细胞和COS-1细胞系。在1960年，Manso等通过使用猪骨髓细胞对ASFV进行传代致弱，发现猪在接种减毒株后能够抵抗强毒株的攻击。但是之后，在西班牙和葡萄牙，使用减毒株进行的田间试验造成了灾难性的后果，免疫动物出现肺炎、流产和死亡等严重的副反应。Tabar’es等[8]比较了ASFV在猪白细胞传代（毒株E70 L6）和在Vero细胞传代（毒株E70MS14）后病毒基因组酶切图谱变化情况，结果显示，在适应Vero细胞生长之前，ASFV毒株E70 L6的DNA大小为l73 kb，传代适应后DNA仅为156 kb，缺失了17 kb。Krug等人将ASFV-G 毒株在Vero 细胞中进行传代培养，传到第110代时毒力完全丧失，病毒的复制能力增强，但是，猪接种该疫苗后未获得相应的免疫保护[9]。通过毒株序列测定，表明该毒株基因组末端出现了大片段的基因缺失和突变，这种突变可能是其适应Vero细胞的原因，但它改变了ASFV-G/V的抗原性，未能诱导保护性免疫反应。

3 ASFV重组弱毒疫苗

随着分子生物学技术发展，使用同源重组方法，可以定点敲除病毒毒力基因或免疫抑制性或免疫逃逸相关基因以降低病毒的毒力，可在短时间内获得致弱毒株，该方法快速简便，其难点在于重组病毒的纯化，使其不含亲本病毒。目前，发现与ASFV毒力相关的基因主要包括：TK、UK、9 GL和CD2v，与免疫逃逸相关基因主要有MGF和A238L，与免疫抑制相关基因有A276R。Abrams等[10]从OUR T88/3 弱毒株中成功敲除了DP71L 和DP96R 基因获得重组病毒OURT88/3ΔDP2，用缺失病毒OUR T88/3ΔDP2 和亲本病毒OUR T88/3 对6 头猪进行免疫接种，并用强毒OUR T88/1 病毒进行攻击，结果基因缺失毒株免疫组OUR T88/3ΔDP2获得了66%的保护，而亲本病毒OUR T88/3提供了100%的保护。该研究结果表明，弱毒株OUR T88/3中敲除DP71L和DP96R两个基因后，免疫猪后用强毒株攻击时，其保护作用减弱，提示这两个基于与免疫保护相关。Gallardo等[11]将PAM细胞传代的NH/P68免疫猪能抵抗Arm07毒株的攻击，但构建的基因缺失株NH/P68△A276R不能抵抗Arm07毒株的攻击。这也证实了A276R在ASFV的免疫保护中发挥着重要作用。O’Donnell等[12]从高加索地区和东欧流行的毒株中分离到一株强毒株Georgia 2007/1（ASFV-G），通过同源重组技术在原代猪肺巨噬细胞中构建了缺失9GL的重组病毒（ASFV-GΔ9GL），用104个HAD50的剂量肌肉注射，可诱导猪产生与亲本毒株ASFV-G一样的临床症状，用较低剂量（102～103HAD50）的ASFV-G-Δ9GL 感染猪不能诱导产生临床症状，当猪在感染后21或28天攻毒时，102HAD50的剂量组获得部分保护，但103HAD50的剂量组在21天和28天攻毒均能获得完全保护。该研究尽管通过同源重组技术获得了致弱毒株，但是该弱毒株的免疫剂量和感染剂量不好控制，很难在临床上使用。因此，在之前的基础上，该研究团队又构建了另一个基因UK（DP96R）缺失的毒株（ASFV-G-Δ9GL/ΔUK）[13]，以进一步致弱毒株，用该毒株高剂量（106HAD5）0肌肉注射猪不会引起发病，当接种104HAD50的剂量时可以保护猪免受强毒株ASFV-G的攻击。Reis 等[14]通过敲除DP148R基因构建重组病毒BeninΔDP148R，该病毒在猪体内的毒力低于亲本病毒，接种猪仅在免疫后显示短暂的轻微临床症状，用亲本病毒攻击后，所有通过肌内途径免疫的猪都存活下来，通过鼻内途径免疫的猪，除一只外，所有猪都存活下来。O’Donnell等[15]敲除Georgia 2007/1分离株（ASFV-G）的MGF505、MGF360-1R、MGF360-12L、MGF360 -13L、MGF360 -14L、MGF505 -2R 和MGF505-3R 6个基因，构建重组病毒ASFV-GΔMGF。在原代猪肺巨噬细胞中，ASFV-G-ΔMGF 的复制效率与亲代病毒一样高。猪肌肉注射后，ASFVG-ΔMGF在体内的复制效率完全减弱。用该弱毒疫苗免疫后，猪能抵抗亲本毒株的攻击。为了解决疫苗的安全问题，他们又构建了一个新的毒株ASFV-GΔ9G/ΔMGF[16]，与ASFV-G和ASFV-G-ΔMGF相比，ASFV-G-Δ9GL/ΔMGF在原代猪肺巨噬细胞中的复制能力降低，当肌内接种猪时，ASFV-G-Δ9GL/ΔMGF即使在106HAD50的高剂量下无致病性。用102～106HAD50剂量感染动物，在感染后的任何时间血液中均未检测到病毒水平，也未检测到抗ASFV的抗体，不能抵抗强毒亲本ASFV-G毒株的攻击。Reis等[17]从ASFV Benin97/1分离株缺失了（MGF360-10L，11L，12L，13L，14L）和MGF530/505（MGF530/505-1R，2R and 3R）和中断基因（MGF360-9L and MGF530/505-4R），命名为BeninΔMGF。BeninΔMGF毒株在猪肺巨噬细胞中的复制与亲本病毒Benin 97/1和天然弱毒分离株OURT88/3没有太大区别。用BeninΔMGF对猪进行两次免疫，然后用致死剂量的Benin 97/1进行攻击，所有猪都获得保护。他们用不同剂量、不同免疫途径研究该疫苗的保护效力，结果表明，使用高剂量（104TCID5）0的肌肉注射途径是最佳的免疫选择。Monteagudo等人[18]以BA71毒株为骨架构建了缺失CD2v基因的重组病毒（BA71ΔCD2），该毒株在猪体内高度减毒，接种BA71ΔCD2 的猪，不仅可以抵抗亲本BA71 的攻击，而且保护猪免受异源毒株E75（两种基因型I株）和Georgia 2007/1（ASFV 基因型Ⅱ株）的攻击。这表明BA71株CD2v基因缺失后，对I型和II型ASFV均能提供完全保护，具有交叉保护作用。国内学者以我国流行的基因II 毒株ASFV HLJ/18为骨架构建了系列基因缺失重组毒株，其中HLJ/18-7GD是缺失7个基因的重组毒株（MGF505-1R、MGF360-12L、MGF360 -13L、MGF360 -14L、MGF505 -2R、MGF505-3R 和CD2v 联合缺失），目前，完成了该疫苗的安全性和免疫效力等试验[19]，该疫苗能否进入市场还需严格的临床试验。国内还有研究表明，ASFV-SY18强毒株缺失CD2v 和UK基因后毒力显著减弱，免疫猪后能够抵抗亲本强毒的攻击，具有候选疫苗的潜力[20]。通过同源重组技术，还有许多敲除ASFV基因组其他位置基因的重组病毒的报道，但目前为止还没商品化的疫苗问世。

4 展望

自肯尼亚于1921年首次报告ASF疫情以来已有100年的历史，科学家对ASF疫苗的研究从未中断，近几十年来ASF疫苗的研究取得了长足的进步，尤其是分子生物学技术的发展，对病毒基础研究的深入，病毒毒力基因的发现、参与免疫逃逸基因和具有保护性抗原的基因的挖掘，对将来研究弱毒疫苗、病毒活载体疫苗、亚单位疫苗具有很大的帮助，相信在不久的将来，安全、有效的ASF疫苗会进入市场，为畜牧业的健康发展提供服务。