球形棕囊藻同化吸收硝酸盐的氮氧稳定同位素分馏研究*

2023-01-17王文涛俞志明宋秀贤郭宏红任向征

海洋与湖沼 2023年1期

王文涛俞志明宋秀贤郭宏红任向征

王文涛1, 2, 3, 4俞志明1, 2, 3, 4①宋秀贤1, 2, 3, 4郭宏红1, 5任向征1, 2, 3, 4

(1. 中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室山东青岛 266071; 2. 青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋生态与环境科学功能实验室山东青岛 266071; 3. 中国科学院海洋大科学研究中心山东青岛 266071; 4. 中国科学院大学北京 100049; 5. 青岛科技大学化学与分子工程学院山东青岛 266042)

球形棕囊藻; 同化吸收; 氮稳定同位素; 氧稳定同位素; 同位素分馏

球形棕囊藻()属于定鞭藻纲, 在南北极及热带的海洋中均有分布, 其存在单细胞和囊体细胞两种可相互转化的生活形态, 是少数具有复杂异型生活史的海洋藻之一(齐雨藻等, 2001)。球形棕囊藻赤潮是一种全球广泛分布的生态灾害, 自1997年以来我国沿海多地也均有相关报道, 暴发时会产生大量溶血性毒素与有机泡沫, 形成最大直径约两到三厘米的囊体, 严重威胁近海的生态健康和人类安全(陈菊芳等, 1999; 齐雨藻等, 2001; 沈萍萍等, 2018)。此外, 球形棕囊藻是重要的二甲基硫化物(dimethyl sulfide, DMS)生产者, 对全球的硫循环和气候调节均有影响(朱蓉等, 2013; 涂俊杰等, 2022)。充分了解球形棕囊藻的生长特性, 摸清环境因素对该赤潮暴发的控制机制, 是相关生态灾害防控的重要基础之一。

氮是海洋浮游植物生长的基础, 在人类活动的影响下, 过量氮营养盐被排放入海, 导致部分海域呈现富营养化特征, 是引发赤潮灾害的重要因素之一。针对球形棕囊藻吸收利用氮营养盐的研究发现, 球形棕囊藻赤潮多暴发于相对较高浓度、较高比例硝酸盐的海域, 如欧洲北海(Tungaraza, 2003)、广西北部湾(Lv, 2019)、深圳大鹏湾等(刘悦等, 2022)。室内培养实验也证实, 球形棕囊藻在硝酸盐为主要氮源体系中具有更高单细胞丰度, 并可以形成囊体(王艳等, 2006, 2013; 梁大勇等, 2018)。基于上述研究可知, 充分了解环境硝酸盐变化对球形棕囊藻生长的影响, 是我们理解球形棕囊藻赤潮暴发机制的关键环节之一。

然而由于海水中的硝酸盐具有高度的时空异质性和环境敏感性, 传统分析方法无法精准刻画其生物地球化学过程, 在阐释硝酸盐迁移转化方面存在较大困难。近些年, 硝酸盐稳定同位素技术逐渐成为研究海洋氮循环和氮驱动生态过程的重要技术。由于其具有氮、氧两种稳定同位素作为限制参数, 因此可以更加精准地解析硝酸盐的来源, 准确刻画关键循环过程(Sigman, 2019)。尽管硝酸盐稳定同位素技术尚未应用于球形棕囊藻赤潮暴发机制方面的研究, 但是作为开展近海富营养化和生态灾害研究的前沿方法, 该技术已在相关领域展现出了极高的应用前景(杨志等, 2012; 陈法锦等, 2013)。

硝酸盐氮、氧稳定同位素技术研究氮循环关键过程建立在稳定同位素分馏效应的基础上, 即某元素的数种稳定同位素在生物作用下以不同速率迁移转化, 使得参与反应的物质产生同位素比值变化, 从而记录相关转化过程的信息(Altabet, 2005; 洪义国, 2013)。例如海洋中的浮游植物在同化吸收硝酸盐时, 理论上会优先利用轻同位素, 导致反应物重同位素富集, 引起同位素比值的变化。因此了解相关过程的分馏系数是利用稳定同位素技术解析物质循环转化的基础。

鉴于目前尚未有相关研究揭示球形棕囊藻同化吸收硝酸盐过程的氮、氧稳定同位素变化及其分馏特征, 通过开展室内培养实验, 获取营养盐浓度、硝酸盐氮、氧稳定同位素等关键参数, 计算球形棕囊藻同化吸收硝酸盐的稳定同位素分馏系数, 分析其变化规律与控制因素, 并与其他海洋藻类的研究结果进行对比。本研究首次获取了球形棕囊藻同化吸收硝酸盐的氮、氧双稳定同位素分馏系数, 丰富了海洋浮游植物同位素分馏数据库, 为硝酸盐稳定同位素技术的运用和球形棕囊藻赤潮暴发机制研究提供了重要的基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究所用藻种为球形棕囊藻(), 取自中国科学院海洋研究所海洋微藻培养库。培养实验所用的海水为经0.45 μm 混合纤维膜过滤后于121 °C 灭菌30 min的天然海水。藻种在f/2培养基(Guillard, 1975), 温度20 °C, 光照度5 000 lx, 光暗比L︰D=12︰12的条件下培养至指数生长期用于实验。

1.2 实验方法

取单个囊体, 离心破碎后, 经200 μm筛绢过滤, 放入灭菌的天然海水中进行饥饿培养, 监测硝酸盐浓度, 待其低于检测限后开始实验。向其中加入f/2培养基, 分装至39个75 cm2的无菌细胞培养瓶, 在20 °C、12︰12光照黑暗比条件下培养, 每2天取3瓶样品, 使用GF/F滤膜过滤100 mL水样, 50 mL滤液加入1滴氯仿固定后置于–20 °C冷冻保存, 用于测定氮、磷、硅等营养盐浓度, 50mL滤液装入无菌洁净离心管中置于-20 °C冷冻保存, 用于测定硝酸盐氮、氧稳定同位素。

1.3 样品分析

1.4 分馏系数计算

球形棕囊藻同位素分馏系数()的计算基于Rayleigh公式:

substrate()＝substrate(=1)–×ln, (1)

其中,代表了反应物的剩余比例,substrate()则代表该时刻反应物的稳定同位素比值,substrate(=1)代表初始时期反应物的稳定同位素比值, 即未发生反应物消耗(=1)时。Rayleigh模型适用于封闭体系, 即在反应过程中未发生反应物的补充。由于本计算是基于反应物的同位素比值变化, 因此可有效避免藻类对海水其他氮源吸收的干扰, 分馏系数更准确。

2 结果与讨论

2.1 球形棕囊藻培养实验五项营养盐变化特征

2.2 球形棕囊藻培养实验硝酸盐氮、氧稳定同位素变化特征

2.3 硝酸盐氮、氧稳定同位素分馏系数变化特征

图2 硝酸盐氮、氧稳定同位素值(δ15N-和δ18O-)随时间的变化特征

图3 硝酸盐氮、氧稳定同位素分馏系数(15ε和18ε)的变化特征

注: 分馏系数从第3天开始计算, 虚线表示第7～25天对应分馏系数的平均值

然而值得注意的是, 在球形棕囊藻同化吸收硝酸盐时, 氮、氧稳定同位素并非一直按照等比或近似等效变化。氮的分馏系数最初达到了14.06‰, 随后逐渐下降, 最终稳定在3.3‰左右, 而氧的分馏则从2.02‰上升至4.91‰, 后稳定在3.1‰左右。这种前期展现出的N、O分馏系数差异可能是受到两方面的因素所致: 一方面可能由于是藻类对外界环境变化的应激响应, 突然增加的氮源导致球形棕囊藻在实验初期同化吸收增强, 产生较高的分馏系数, 而后随球形棕囊藻对环境适应, 其产生的硝酸盐分馏系数降低; 而另一方面可能由于剧烈的硝酸盐跨膜运输所致(Karsh, 2014)。后者的详细讨论将与2.4部分中的不同微藻间分馏系数比较一起叙述。

2.4 典型微藻同化吸收硝酸盐的稳定同位素分馏系数对比

目前针对海洋微藻同化吸收硝酸盐过程所引发的同位素分馏情况, 国内外已有一定的研究积累。总体来看, 海洋微藻氮、氧稳定同位素分馏具有较大范围, 按照纲的分类, 大部分的微藻的15呈现甲藻纲<蒲林藻纲<硅藻纲的特征(表1)。本研究的球形棕囊藻15和18分别为3.32‰±0.38‰和3.12‰±0.59‰, 恰好符合这一特点。这可能与藻类本身对营养盐的同化吸收特性相关。

表1 典型海洋微藻同化吸收硝酸盐的稳定同位素分馏系数

续表

注:a: 本研究;b:Needoba(2003);c: Montoya(1995);d: Wada (1980);e: Granger(2004);f:Waser(1998);g:Wada(1978);h:Pennock(1996);I: Granger(2010)

此外, 藻类同化吸收引起的稳定同位素分馏系数大小既取决于藻类自身特性, 也与藻的培养方式有关。当黑暗等减缓藻细胞光合作用时, 硝酸盐向胞外的释放速率与硝酸盐在胞内的还原速率可以达到相对较高比例, 胞内经还原酶改造的硝酸盐同位素信号释放到胞外, 从而降低胞内外的硝酸盐稳定同位素差异, 令基质稳定同位素值与分馏系数升高(Needoba, 2004)。综上, 本实验使用的12︰12光照培养方式, 以及计算的15和18值, 可较客观反映球形棕囊藻同化吸收硝酸盐过程的分馏系数特征。

图4 浮游植物同化吸收硝酸盐的过程示意与发生的稳定同位素分馏(参考自Karsh et al, 2014)

注:in表示进入细胞膜的分馏,out表示出细胞膜的分馏,NR表示硝酸盐还原的分馏, NR表示硝酸盐还原, Norg表示有机氮

3 结论与展望

本文开展了针对球形棕囊藻()同化吸收硝酸盐的氮、氧稳定同位素分馏研究。结果表明:

(2) 球形棕囊藻同化吸收硝酸盐过程的15和18均值分别为3.32‰±0.38‰和3.12‰±0.59‰, 二者呈现1︰1的比例特征, 分馏系数小于大部分的硅藻纲而大于甲藻纲;

(3) 根据微藻同化吸收与硝酸盐跨膜运输等多个过程对同位素分馏的影响, 球形棕囊藻生长前中期的硝酸盐还原酶活性较高, 可能是引起氮分馏系数由高逐渐降低的重要原因。

本结果首次给出了球形棕囊藻的氮、氧稳定同位素分馏系数, 补充了海洋微藻同位素分馏数据库, 为稳定同位素技术研究赤潮暴发的环境驱动机制提供关键基础数据。在此基础上, 后续可以进一步开展针对球形棕囊藻微观环境氮循环过程的研究, 精准阐明营养环境对球形棕囊藻不同生活史阶段和赤潮暴发的影响, 以期为近海赤潮灾害研究提供重要支撑。

王艳, 邓坤, 王小冬, 2013. 球形棕囊藻囊体形成中光照、营养盐和共存硅藻的影响[J]. 生态科学, 32(2): 165-170.

王艳, 唐海溶, 蒋磊, 等, 2006. 硝酸盐对球形棕囊藻生长和硝酸还原酶活性的影响[J]. 植物学通报, 23(2): 138-144.

朱蓉, 杨桂朋, 于娟, 等, 2013. 不同氮磷比及铁浓度对球形棕囊藻二甲基硫和二甲巯基丙酸内盐生产的影响[J]. 中国海洋大学学报, 43(10): 67-75.

刘悦, 李丽, 翟晓辉, 等, 2022. 深圳大鹏湾一次球形棕囊藻藻华的发生过程及成因分析[J]. 热带海洋学报, 41(3): 164-171.

齐雨藻, 沈萍萍, 王艳, 2001. 棕囊藻属()的分类与生活史(综述)[J]. 热带亚热带植物学报, 9(2): 174-184.

杨志, 陈敏, 2012. 海水硝酸盐氮、氧同位素组成研究进展[J]. 地球科学进展, 27(3): 268-275.

沈萍萍, 齐雨藻, 欧林坚, 2018. 中国沿海球形棕囊藻()的分类、分布及其藻华[J]. 海洋科学, 42(10): 146-162.

陈法锦, 陈建芳, 张海生, 2013. 硝酸盐氮氧同位素在海洋氮循环中的应用进展[J]. 矿物岩石地球化学通报, 32(1): 127-133.

陈菊芳, 徐宁, 江天久, 等, 1999. 中国赤潮新记录种──球形棕囊藻()[J]. 暨南大学学报(自然科学版), 20(3): 124-129.

洪义国, 2013. 硝酸盐氮氧稳定同位素分馏过程记录的海洋氮循环研究进展[J]. 地球科学进展, 28(7): 751-764.

涂俊杰, 高配配, 刘春颖, 等, 2022. 不同氮磷比对球形棕囊藻释放含硫化合物及DMSP降解途径的影响[J]. 中国海洋大学学报, 52(4): 87-96.

梁大勇, 王小冬, 王艳, 2018. 不同氮源对球形棕囊藻生长和囊体形成的影响[J]. 海洋科学进展, 2018, 36(2): 272-278.

ALTABET M A, 2005. Isotopic tracers of the marine nitrogen cycle: present and past [M] // Marine Organic Matter: Biomarkers, Isotopes and DNA. Berlin, USA: Springer: 251-293.

CASCIOTTI K L, SIGMAN D M, HASTINGS M G,, 2002. Measurement of the oxygen isotopic composition of nitrate in seawater and freshwater using the denitrifier method [J]. Analytical Chemistry, 74(19): 4905-4912.

GRANGER J, SIGMAN D M, NEEDOBA J A,, 2004. Coupled nitrogen and oxygen isotope fractionation of nitrate during assimilation by cultures of marine phytoplankton [J]. Limnology and Oceanography, 49(5): 1763-1773.

GRANGER J, SIGMAN D M, ROHDE M M,, 2010. N and O isotope effects during nitrate assimilation by unicellular prokaryotic and eukaryotic plankton cultures [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 74(3): 1030-1040.

GUILLARD R R L, 1975. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates [M] // Culture of Marine Invertebrate Animals. Boston, USA: Springer: 29-60.

KARSH K L, GRANGER J, KRITEE K,, 2012. Eukaryotic assimilatory nitrate reductase fractionates N and O isotopes with a ratio near unity [J]. Environmental Science & Technology, 46(11): 5727-5735.

KARSH K L, TRULL T W, SIGMAN D M,, 2014. The contributions of nitrate uptake and efflux to isotope fractionation during algal nitrate assimilation [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 132: 391-412.

MONTOYA J P, MCCARTHY J J, 1995. Isotopic fractionation during nitrate uptake by phytoplankton grown in continuous culture [J]. Journal of Plankton Research, 17(3): 439-464.

NEEDOBA J A, SIGMAN D M, HARRISON P J, 2004. The mechanism of isotope fractionation during algal nitrate assimilation as illuminated by the15N/14N of intracellular nitrate [J]. Journal of Phycology, 40(2): 517-522.

NEEDOBA J A, WASER N A, HARRISON P J,, 2003. Nitrogen isotope fractionation in 12 species of marine phytoplankton during growth on nitrate [J]. Marine Ecology Progress Series, 255: 81-91.

PENNOCK J R, VELINSKY D J, LUDLAM J M,, 1996. Isotopic fractionation of ammonium and nitrate during uptake by: Implications for15N dynamics under bloom conditions [J]. Limnology and Oceanography, 41(3): 451-459.

SIGMAN D M, CASCIOTTI K L, ANDREANI M,, 2001. A bacterial method for the nitrogen isotopic analysis of nitrate in seawater and freshwater [J]. Analytical Chemistry, 73(17): 4145-4153.

SIGMAN D M, FRIPIAT F, 2019. Nitrogen isotopes in the ocean [J]. Encyclopedia of Ocean Sciences, 1: 263-278.

TUNGARAZA C, ROUSSEAU V, BRION N,, 2003. Contrasting nitrogen uptake by diatom and- dominated phytoplankton assemblages in the North Sea [J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 292(1): 19-41.

WADA E, 1980. Nitrogen isotope fractionation and its significance in biogeochemical processes occurring in marine environments [M] // GOLDBERG E D, HORIBE Y. Isotope Marine Chemistry. Tokyo, Japan: Uchida-Rokakuho: 375-398.

WADA E, HATTORI A, 1978. Nitrogen isotope effects in the assimilation of inorganic nitrogenous compounds by marine diatoms [J]. Geomicrobiology Journal, 1(1): 85-101.

WASER N A D, HARRISON P J, NIELSEN B,, 1998. Nitrogen isotope fractionation during the uptake and assimilation of nitrate, nitrite, ammonium, and urea by a marine diatom [J]. Limnology and Oceanography, 43(2): 215-224.

NITROGEN AND OXYGEN STABLE ISOTOPIC FRACTIONATION OF NITRATE ASSIMILATION BY

WANG Wen-Tao1, 2, 3, 4, YU Zhi-Ming1, 2, 3, 4, SONG Xiu-Xian1, 2, 3, 4, GUO Hong-Hong1, 5, REN Xiang-Zheng1, 2, 3, 4

(1. CAS Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266071, China; 3. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 4. University of Chinese Academy, Beijing 100049, China; 5. College of Chemistry and Molecular Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China)