益生菌调节肠道黏膜免疫研究进展

王 涛，田欣蕾，张 迪，李 娜，钱爱东，单晓枫，王春凤，张冬星*

(1.吉林农业大学 动物科学技术学院/动物医学学院，吉林 长春 130118;2.牡丹江市农业农村局，黑龙江 牡丹江 157020)

黏膜免疫系统作为抵御病原微生物入侵的第一道生理屏障，能阻止病原微生物和抗原等物质通过黏膜位点侵入宿主。肠道作为巨大的免疫细胞库，可识别外来抗原并抵御微生物入侵。此外，肠免疫细胞及其分泌的黏液可作为调节黏膜免疫功能的生物屏障，在阻断病原侵袭过程中发挥保护作用。上皮细胞通过病原识别受体将来自微生物群的信号传递给黏膜免疫细胞从而降低抗原与免疫细胞的过度接触，进而调节黏膜感染、炎症和稳态等相关免疫反应[1]。肠道微生物与肠上皮免疫细胞的互作对肠道免疫稳态具有重要意义。诸多研究证实，益生菌具有免疫调节特性，能改善黏膜上皮屏障功能，调节肠道菌群，并增强黏膜固有层中免疫相关细胞的活性，修复上皮细胞炎症并增强黏膜免疫功能[2]。据报道，肠道菌群与宿主健康、疾病密切相关，益生菌在调节肠道菌群结构、代谢及免疫学等领域中发挥作用，因此对研究肠道菌群具有重要意义[3]。

1 黏膜上皮屏障

1.1 柱状上皮细胞柱状肠上皮细胞是绒毛上皮中的主要细胞之一，其功能是吸收营养物质并维持黏膜屏障的完整性。此外，由紧密连接相关蛋白、封闭蛋白及连接黏附分子组成的紧密连接分布于肠上皮细胞间隙，能阻止亲水溶质与细菌进入黏膜固有层。细胞间紧密连接的破坏会增加上皮细胞通透性，导致共生微生物移位至黏膜固有层，其代谢产物可能会引起宿主急性或慢性炎症反应。上皮细胞通过与淋巴细胞、微生物之间的相互作用，可产生多种细胞因子和相关免疫细胞，激活局部黏膜免疫应答从而有效缓解炎症与感染[4]。

1.2 杯状细胞杯状细胞是分泌型肠上皮细胞，可分泌黏液覆盖于黏膜表面，利于肠黏膜润滑和内容物转运。黏液层能有效防止细菌与上皮细胞表面过度接触，进而减少病原的侵袭感染。黏液中富含黏蛋白，此类蛋白可自主形成保护性黏液层，覆盖于上皮细胞表面[5]。肠内共生菌可诱导杯状细胞分泌黏蛋白并调节共生菌比例。黏蛋白2(mucin 2,MUC2)是杯状细胞分泌最丰富的黏蛋白之一[4]。OLIVIER等[6]利用葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的结肠炎模型探究肠上皮细胞对特异性AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的保护机制，该研究发现杯状细胞的数量依赖于muc2基因表达的调控。

杯状相关抗原通道(goblet-associated antigen passages,GAPs)是杯状细胞具有非专职抗原递呈细胞作用的通道(图1)。研究证实，当小鼠缺乏杯状细胞时，树突细胞显示出对T细胞的管腔抗原呈递减少[7]。GAPs利用杯状细胞将腔内可溶性低相对分子质量的抗原传递至肠上皮表面的树突细胞。

图1 肠黏膜免疫细胞

1.3 Paneth细胞Paneth细胞位于小肠隐窝底部干细胞间隙，是肠道黏膜防御系统中的关键效应细胞之一。Paneth细胞产生的抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)分布于黏液层中，可通过调节肠道微生物群的结构与丰度保护肠道上皮免受外来病原体的侵害。防御素家族蛋白中α-防御素(在小鼠中也称为隐窝蛋白)在Paneth细胞中表达量最高，其中α-防御素5和α-防御素6已被证实可激活黏膜免疫反应[8]。AYABE等[9]研究表明，健康小鼠肠道隐窝中防御素质量浓度可达15～100 g/L，高于体外最小杀菌浓度1 000倍，该结果表明防御素可能在维持肠隐窝无菌环境与保护局部干细胞等方面发挥关键作用。

此外，Paneth细胞中的髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)可调节胰岛再生源蛋白(regenerating islet-derived protein,Reg)家族RegⅢγ的产生。RegⅢ家族蛋白是C型凝集素，其通过与细胞壁肽聚糖结合形成六聚体膜透性寡聚孔，从而对革兰阳性菌产生抗菌作用。据报道，小鼠体内缺乏RegⅢγ会导致自发性结肠炎[10]。

1.4 Tuft细胞Tuft细胞在肠道抗寄生虫反应中发挥重要作用，可在寄生虫感染期间迅速做出黏膜免疫应答。SPITS等[11]和GERBE等[12]研究发现，随着蠕虫感染和过敏原沉积，导致Tuft细胞和杯状细胞数量迅速增加，同时促进了小鼠肠道内Tuft细胞分泌IL-25，通过激活局部2型固有淋巴细胞(type 2 innate lymphoid cells,ILC2s)分泌IL-13，诱导黏蛋白产生从而有效清除蠕虫。

1.5 微褶皱细胞(M细胞)肠上皮含有多个用于主动跨细胞或摄取腔内微生物的细胞通道和途径。位于派伊尔氏集合淋巴小结(Peyer’s patch,PP)的滤泡相关上皮(follicle associated epithelial,FAE)中的M细胞是跨细胞级联反应和启动抗原特异性反应的核心细胞。M细胞具有顶部短而不规则微绒毛的特征，该结构易于接触肠腔内抗原[13]。

M细胞可将抗原从肠腔递呈至下方的淋巴组织从而诱导黏膜免疫。此外，具有胞吞转运作用的M细胞和基底外侧淋巴细胞能将大分子物质从肠腔递呈至PP内部[14]。如图1所示PP结中的树突状细胞可通过M细胞的跨细胞孔进入肠腔，表明该过程需要抗原递呈细胞和处理细胞(分别为M细胞和树突状细胞)之间的相互作用，以协调抗原从肠腔到PP结内，从而启动抗原特异性黏膜免疫反应(如分泌特异性sIgA)[15]。

研究表明，小鼠感染肠沙门菌(Salmonellaenterica)后，M细胞的糖蛋白2(glycoprotein 2,GP2)作为抗原摄取受体可通过激活T细胞来促进黏膜免疫反应[16]。HASK等[17]构建重组菌株携带GP2，使得细菌抗原有效地转运至M细胞中并启动抗原特异性黏膜免疫反应。SHIMA等[18]将抗GP2融合蛋白(链霉亲和素与抗鼠GP2抗体的抗原结合区融合)与鼠伤寒沙门菌的生物素化裂解物共同给药可有效诱导黏膜免疫反应。

1.6 肠内分泌细胞肠内分泌细胞可分泌多种激素，约占肠上皮细胞总数的1%。肠嗜铬细胞(enterochromaffin cells,EC)是肠内分泌细胞的最大群体，可合成并释放5羟色胺(5-HT)，EC细胞含有人体90%以上的5-HT。SPOHN等[19]发现，在小鼠体内5-HT4上皮细胞的激活可有效保护黏膜组织并促进损伤组织修复。在健康动物中阻断5-HT4会导致结肠炎和肠道屏障细菌移位。SHAJIB等[20]研究表明,5-HT受体可在多数免疫细胞中表达，蠕虫感染后5-HT水平增加可通过刺激巨噬细胞激活先天免疫细胞介导的免疫应答。

1.7 共生菌群共生微生物群统称为肠道微生物区系，可激活肠道免疫系统保护宿主免受病原菌的干扰。共生菌在肠道相关淋巴组织(gut associated lymphoid tissue,GALT)内定居，也被称为淋巴组织驻留共生菌(lymphoid-tissue-resident commensal bacteria,LRC)。LRC在发展和维持与协调肠黏膜免疫中发挥关键作用。LRC通过递呈细胞(dendritic cell,DC)，刺激天然淋巴细胞ILC3，随后诱导上皮内淋巴细胞(innate lymphoid cells,ILCs)分泌抗菌肽。因此，LRC通过间接刺激抗菌肽的产生来维持免疫反应[21]。

共生细菌可诱导肠道产生分泌型免疫球蛋白(secretory Immunoglobulin A,sIgA)。该抗体由固有层浆细胞产生，是肠黏膜免疫系统特有的免疫球蛋白[22]。sIgA通过结合病原体表面抗原并中和其毒素进而保护肠道屏障，也能限制致病菌穿越肠上皮细胞引发的炎症反应。同时，sIgA也可通过抑制病原生物膜形成，预防上皮屏障的细菌易位。

2 益生菌

益生菌是指“当给予适宜的量时，赋予宿主健康益处的活微生物”。益生菌可防止病原体定殖和黏膜感染。另一方面，还可通过稳定肠黏膜、增加黏液分泌和改善肠道蠕动来保护并治疗肠道疾病。本团队在健康鲫鱼中分离出具有优良特性的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)，口服接种鲫鱼后上调了肠道、头肾等组织中IL-1β、IL-10及TNF-α等细胞因子的表达水平，且促进了血清与肠黏液中特异性免疫球蛋白IgM的分泌。研究结果表明，该菌通过维持肠道屏障功能可有效抵御致病性维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)的感染(保护率75.0%)[23]。

多种益生菌具有保守的微生物相关分子模式，可被某些模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)识别并激活信号通路，同时也可诱导细胞因子、趋化因子和其他效应分子的产生，从而激活宿主的免疫反应[24](表1)。在养殖中应用益生菌可有效改善动物生长性能、免疫应答和抗病性，被视为抗生素的替代品之一。

表1 益生菌的相关免疫作用

传统益生菌在预防或治疗疾病中的主要限制是其定植能力低，与病原体竞争和发挥免疫调节作用的能力较弱[32]。为克服传统益生菌的局限性，近年来诸多研究开发了新功能型益生菌作为疫苗或药物递送载体，用于致病菌的预防或治疗领域。这类益生菌具备以下优点：(1)能够在黏膜表面定植；(2)对胃酸和肠液具有较强耐受性，使其能够长期存活于消化道环境；(3)持续定植并持续表达保护性抗原提供长期保护[33]。

DROLIA等[34]研究发现，使用靶向病原体基因产物可增强益生菌对黏膜表面的黏附能力，达到与病原菌竞争黏附位点的目的。通过构建重组副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)，表达单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)的黏附蛋白基因，进而降低致病性Lm 的黏膜定植和全身扩散，显著提高了小鼠存活率。PICHET等[31]对大肠杆菌Nissle 1917(EscherichiacoliNissle 1917,EcN)进行基因工程改造，观察到工程益生菌EcN对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠结肠炎的保护作用增强，并促进上皮修复和紧密连接蛋白的表达。

3 益生菌的作用机制

3.1 竞争结合位点体内竞争结合位点被视为益生菌预防病原体侵袭的主要方式之一。肠道上皮细胞表面的一些受体可与表达黏附相关蛋白的益生菌相结合进而与病原菌竞争受体结合位点,可拮抗病原体并减少定植[35]。DROLIA等[32]利用工程乳酸杆菌益生菌(bioengineeredLactobacillusprobiotics,BLP)在干酪乳杆菌表面表达Lm黏附蛋白(Listeriaadhesion protein,LAP)(图2)，结果证实BLP菌株在肠道内可持续定植，并减少李斯特菌的黏膜定植和系统性扩散，提高小鼠免存活率。此外，研究发现工程菌表达的黏附蛋白能与宿主肠上皮细胞受体热休克蛋白60(heat shock protein60,Hsp60)互作，竞争性地排斥致Lm，并通过抑制NF-κB信号通路和肌球蛋白轻链激酶介导的主要上皮连接蛋白的重新分布来改善致病性Lm引起的肠屏障功能障碍。

图2 BLP通过竞争结合位点预防致病李斯特菌的感染[32]

3.2 调节黏液层肠上皮细胞由黏液层覆盖，避免过量细菌黏附于上皮细胞，从而防止其侵入黏膜固有层引发炎症。特定的益生菌已被证明可调节黏蛋白的表达，从而影响黏液层的结构，并间接调节肠道免疫系统。MACK等[36]研究报道，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)299v菌株能抑制致病性大肠杆菌对肠上皮细胞HT-29的黏附作用。Lactobacillusplantarum299v可诱导上皮细胞分泌黏蛋白，减少肠道致病菌与黏膜上皮细胞的结合数量。此外，益生菌EcN也被证实可改变黏蛋白基因的表达，特别是可提升HT-29细胞中MUC2、MUC3和MUC5AC基因的表达水平[37]。

3.3 调节紧密连接肠黏膜上皮外部环境和宿主免疫系统之间建立的物理屏障，能有效保护宿主免受外界威胁。黏膜上皮的完整性依赖紧密连接TJs(tight junctions,TJs)的多蛋白复合体。在TJ蛋白的表达或定位改变后，肠道物理屏障的功能被破坏，导致肠道通透性升高，诱发肠道疾病如炎症性肠道疾病(inflammatory bowel disease,IBD)、肠易激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)和糜烂性疾病。UKENA等[38]研究发现，益生菌EcN1917能持续定植于小鼠肠道，促进小鼠肠上皮细胞中紧密连接蛋白ZO-1的表达。将其应用于小鼠结肠炎模型时，可观察到ZO-1表达显著上调，通过调节肠上皮细胞间通透性而改善肠上皮的屏障功能。鼠李糖乳杆菌LGG(LactobacillusrhamnosusLGG)对肠出血性大肠杆菌O157:H7感染具有保护作用，经LGG处理的上皮细胞可使其保持表达较高水平的ZO-1[39]。

3.4 调节免疫与炎症先天免疫反应作为抗感染的第一道防线，保护宿主机体免受传染病感染。LABARRERE等[40]研究发现饲喂丁酸梭菌的虹鳟鱼可通过改变白细胞吞噬活性抵御弧菌感染。本团队以鱼源干酪乳杆菌CC16为递送载体构建表达维氏气单胞菌外膜蛋白基因(OmpAI)的工程益生菌，将其接种鲤鱼后可促进肠道、头肾等组织内炎性细胞因子IL-β、IFN-γ及TNF-α基因表达，并能有效抵御维氏气单胞菌的感染[41]。为进一步提升工程菌的免疫效果，项目组在此基础上插入鲤鱼补体基因C5-I，使其作为分子佐剂与外膜蛋白融合表达，结果显示新型工程菌可显著提升鱼类的局部黏膜免疫应答[42]。

此外，干酪乳杆菌Shirota可通过抑制脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的小鼠慢性IBD细胞中IL-6和IFN-γ的合成而发挥抗炎作用[43]。德氏乳杆菌对大肠固有层单核细胞NF-κB通路具有抑制作用，在接受益生菌治疗之后，可抑制小鼠溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)疾病扩散并且防止黏膜侵袭[44]。用含有嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和链球菌的复合益生菌产品治疗2个月后，显示益生菌可通过降低促炎因子IL-1β的表达，提升抗炎因子IL-10的表达及特异性抗体的分泌，缓解UC症状及结肠黏膜的损伤[45]。

4 展望

肠上皮屏障包括柱状上皮细胞、杯状细胞和Paneth细胞等多种免疫细胞，对肠道免疫稳态平衡具有重要作用。肠道黏膜由黏蛋白覆盖以抵御肠腔内病原菌。抗菌肽和sIgA可刺激肠道免疫反应，M细胞和杯状细胞摄取的微生物转移至肠组织则促进了黏膜免疫反应。肠道内的共生菌群可调节局部黏膜免疫应答。研究人员需进一步探究肠道共生微生物群的关键作用，并对益生菌与黏膜免疫之间的相互关系进行系统性研究，为益生菌治疗、修复黏膜上皮屏障机制等研究提供基础。而对宿主和病原体互作研究的不断深入，也促进了用于新型靶向工程益生菌的开发。还可研究筛选更加有效的分子佐剂及受体靶向型益生菌，提高工程菌的抗原递呈能力与异源蛋白表达量。另外，此类工程菌应用抗生素作为筛选标记的质粒表达系统，易造成抗性基因转移、威胁生态环境等风险。目前，利用无痕突变技术(例如温敏型质粒pG+host9，CRISPR/Cas9 系统整合和敲除靶标基因)基因组编辑系统构建工程菌是未来微生态制剂研发的重要方向之一。此外，工程菌株在人体或动物临床中的应用，可能受宿主饮食习惯和肠道菌群等多方面因素的影响。因此，全面开发安全、有效的工程益生菌，将为肠道相关疾病的治疗和预防提供更好的选择。