血清LncRNA NEAT1、LncRNA H19在NAFLD及肝纤维化疾病的临床应用价值研究*

段雨函,吴 钢

湖北省恩施州中心医院临床检验中心,湖北恩施 445000

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)为肝脏脂质代谢异常的疾病，是最常见的导致慢性肝脏疾病的诱因之一[1]。NAFLD是主要特征为肝细胞内存在过多脂肪沉积的临床病理综合征，是一种获得性代谢应激性肝损伤，与胰岛素抵抗存在相关性[2]。肝细胞调查数据表明NAFLD是最常见的全球性慢性肝病，目前全球约有30%的人群均为NAFLD患者，且患病人数呈持续增加的趋势[3]。NAFLD主要存在两种类型：80%为单纯性脂肪肝，是一种良性的临床过程[4]。10%～20%为非酒精性脂肪性肝炎，是一种潜在的严重疾病，除了存在脂肪变性的情况，还有肝细胞炎症以及肝纤维化[5]。肝纤维化是NAFLD向肝硬化和肝细胞癌发展的关键步骤，是肝脏内结缔组织出现异常增生的病理过程[6]。有研究表明，长链非编码RNA(LncRNA)在肝脏疾病的病理过程中发挥重要的调控作用，若表达失常可导致肝脏内脂质代谢异常[7]。随着现代医学技术的高速发展，LncRNA在肝脏方面的临床研究逐渐深入。其中LncRNA NEAT1和LncRNA H19是LncRNA中的两个家族成员，现为了探究LncRNA NEAT1、LncRNA H19与NAFLD及肝纤维化发病风险的相关性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取于本院2018年8月至2021年8月确诊为NAFLD的85例患者作为研究对象，根据患者肝纤维化程度分为NAFLD轻度组(31例)、NAFLD中度组(32例)、NAFLD重度组(22例)。根据NAFLD严重程度分类标准分为轻度(肝脏密度轻微降低，脾、肝Ct值比值为0.7～1.0)；中度(肝血管不清，脾、肝Ct值比值为>0.5～<0.7)；重度(肝脏密度显著降低，脾、肝Ct值比值为≤0.5)。纳入标准：(1)符合《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》[8]中的诊断标准；(2)重要器官功能正常。排除标准：(1)酒精性、病毒性肝病；(2)药物性肝炎；(3)合并感染、免疫系统疾病或其他系统的恶性肿瘤。NAFLD轻度组(31例)中男15例，女16例，平均年龄(46.23±12.62)岁；NAFLD中度组(32例)中男18例，女14例，平均年龄(44.95±13.28)岁；NAFLD重度组(22例)中男12例，女10例，平均年龄(45.46±11.39)岁。另选择本院同期进行健康体检的68例体检健康者作为对照组，其中男38例，女30例，平均年龄(47.28±12.58)岁。4组研究对象性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会同意。

1.2方法 (1)采集NAFLD轻度组、中度组、重度组及对照组清晨空腹时的肘静脉血5 mL，以3 000 r/min的速度离心15 min，取上清液1 000 μL，采用化学免疫发光法进行肝纤维化指标[Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、层黏连蛋白(LN)、透明质酸(HA)]检测，所用试剂盒(北京晶美生物工程有限公司)严格按照说明书进行使用。(2)采用新型总RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)对4组患者血清标本中的总RNA进行提取。使用AMV试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)对提取得到的总RNA进行反转录，得到cDNA，再以cDNA为模板，使用7500型实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems 公司，美国)进行反转录-聚合酶链式扩增(RT-PCR)。引物序列如下：LncRNA NEAT1上游引物正向：5′-GUC UGU GUG GAA GGA GGA ATT-3′，下游引物反向：5′-UUC CUC CUU CCA CAC AGA CTT-3′。LncRNA H19上游引物正向：5′-CCT CTA GCT TGG AAA TGA A-3′，下游引物反向：5′-GAC GTG AGA AGC AGG ACA T-3′。采用2-ΔΔCt方法进行数据分析，得到患者血清中的LncRNA NEAT1和LncRNA H19的表达水平。

2 结 果

2.14组研究对象肝纤维化指标比较 对4组研究对象的肝纤维化指标进行比较，得到NAFLD患者血清中PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平由小到大依次为NAFLD轻度组、中度组、重度组，且均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组研究对象肝纤维化指标比较

2.24组研究对象血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表达水平比较 对4组研究对象血清中的LncRNANEAT1、LncRNAH19表达水平进行比较，可得NAFLD轻度组患者的LncRNANEAT1表达水平最低，其次是中度组患者，表达水平最高的是重度组，且3组表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。NAFLD轻度组患者的LncRNAH19表达水平最低，其次是中度组患者，表达水平最高的是重度组，且3组表达水平均明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 4组研究对象血清中LncRNA NEAT1、LncRNA H19的表达比较

2.3血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19表达水平与肝纤维化指标相关性 经Spearman相关性分析可知，LncRNANEAT1与NAFLD患者肝纤维化指标PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平均呈正相关(P<0.05)；LncRNAH19与NAFLD患者肝纤维化指标PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平均呈正相关(P<0.05)。见表2。

表2 血清中LncRNA NEAT1、LncRNA H19表达与肝纤维化指标相关性

2.4ROC曲线分析 经ROC曲线分析可得，LncRNANEAT1、LncRNAH19诊断NAFLD的截断值分别为3.22、1.71；诊断的曲线下面积(AUC)分别为0.790、0.734、0.880。见图2、表3。

图2 NAFLD诊断ROC曲线图

表3 血清中LncRNA NEAT1、LncRNA H19表达水平诊断NAFLD的价值

3 讨 论

NAFLD是一种代谢应激性的肝脏损伤，与胰岛素抵抗以及遗传易感存在密切相关性，其病理变化过程与酒精性肝病相似，但患者无过量饮酒史。研究证明，NAFLD患者常有糖尿病、高血压、高血脂等代谢综合征伴随出现，若不注意防护，极易发展为肝硬化甚至肝细胞癌[10]。有数据表明，近年来我国的NAFLD发病率越来越高，且发病人群也越来越年轻[11]。肝癌早期无特异性临床症状，晚期却无有效治疗手段，因此防治NAFLD发展为肝癌也是降低肝癌死亡率的有效方法。NAFLD目前的发病概率已经明显高于酒精性、病毒性肝病，但其发病机制还有待探究，研究认为其与基因、生活习惯及环境等因素存在相关性[12]。NAFLD患者肝内脂肪酸有60%均来自于组织中，其余均来自肝内脂肪和日常饮食，在患者病理变化过程中，肝细胞长期浸润于脂质中会出现细胞变性、凋亡，最终转化成肝纤维化，导致肝硬化[13]。因此，NAFLD的早期诊断非常重要，临床上有越来越多的研究聚焦于通过血清标志物对NAFLD进行诊断和评估[14]。几乎所有的慢性肝损伤均会转化为肝纤维化，该过程是由肝实质、肝星状及肝窦内皮细胞等一系列涉及细胞因子相互作用所引导[15]。有研究认为通过对患者的肝纤维化指标检测可诊断NAFLD的严重程度，肝纤维化指标包括PCⅢ、CⅣ、HA及LN，均为血管及细胞的重要组成部分，可灵敏地反映患者肝纤维化情况[16]。

LncRNA是一组RNA分子，并且该RNA分子无法编码蛋白。2007年，有研究报道一条功能性长编码RNA，可以通过修饰染色质，参与基因的转录，该研究说明LncRNA有可能对基因表达发挥调控作用[17]。已有研究表明，LncRNA在调控纤维化因子的同时，也受到纤维化因子的调控，LncRNA的异常表达导致肝纤维化的产生[18]。LncRNANEAT1最早发现于分泌腺肿瘤中，接着又有研究发现肺癌组织中LncRNANEAT1出现过度表达，且与肿瘤的分期、转移、预后差等临床病例特征存在相关性[19]。当LncRNANEAT1表达水平降低时，肿瘤细胞的增殖和侵移受到明显抑制。研究发现LncRNAH19过度表达加重肝纤维化，该通路主要是对胆汁酸代谢进行调控[20]。胆汁酸代谢出现异常时，高浓度的胆汁酸对上皮细胞产生损害，导致肝细胞于高浓度胆汁酸中暴露，进而巨噬细胞浸润，最终肝细胞死亡。

本文对4组研究对象的肝纤维化指标进行比较，可得到血清中的PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平最高的均是NAFLD重度组，其次是中度组，再是轻度组，最低的是对照组。PCⅢ、CⅣ、LN、HA均为细胞和血管的生成物，当患者肝纤维化程度越高时，其水平升高促进细胞分化增殖和新生血管的形成。通过对4组研究对象血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表达水平比较可得，NAFLD重度组患者血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表达水平均为最高，其次是NAFLD中度组患者，再是NAFLD轻度组患者，表达水平最低的是对照组患者。由此说明，LncRNANEAT1、LncRNAH19的表达水平越高，NAFLD患者的病情越严重。LncRNANEAT1对肝纤维化因子进行调控，当患者NAFLD病情加重时，LncRNANEAT1表达水平升高发挥作用。LncRNAH19在NAFLD患者体内通过过表达，对还原性辅酶Ⅱ氧化酶4进行调节，从而发挥保护肝功能及肝损伤的作用。经过Spearman相关性分析，得到血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表达水平与NAFLD患者临床肝纤维化指标PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平均呈正相关。说明，血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表达水平越高，则NAFLD患者的肝纤维化程度越严重。当患者出现肝纤维化时，机体通过提高血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表达水平，对患者肝细胞的增生与分化发挥调控作用，从而保护肝功能，避免进一步发展为肝硬化、肝细胞癌。经过ROC曲线分析可以得到，LncRNANEAT1诊断NAFLD的截断值为3.22，AUC为0.790；LncRNAH19诊断的截断值为1.71，AUC为0.734；二者联合诊断的AUC为0.880。比较可以得到将两个指标联合检测，可提高诊断NAFLD及肝纤维化的特异度及灵敏度。本研究也存在一些不足，如样本量较小等，需在以后的研究中对其进行扩大，使研究结果更有参考意义。

综上所述，NAFLD患者病情恶化，血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19水平及肝纤维化指标PCⅢ、CⅣ、LN、HA的表达水平均随之升高。血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表达水平与肝纤维化指标PCⅢ、CⅣ、LN、HA水平呈正相关。患者血清中LncRNANEAT1、LncRNAH19的表达水平可用于诊断患者病情，二者联合诊断价值更高。