芪丹通脉片下调NLRP3 炎症小体对巨噬细胞泡沫化进程的影响

王南丁 陈晋玉 李成龙 胡乔斌 雷瑗琳 张莎 李哲

研究表明,发生急性冠状动脉综合征(acute coronary syndromes,ACS)的关键因素是不稳定斑块破裂或糜烂,诱发急性血栓形成[1],所以干预这一环节对临床防治ACS 至关重要,其中氧化低密度脂蛋白(oxidized low densitylipoprotein,ox-LDL)被巨噬细胞摄取,泡沫细胞的形成是不稳定斑块发生的关键因素[2-3]。 充分的研究证据证实炎症机制在不稳定斑块的发生、发展过程中扮演着至关重要的作用,其中大量的研究数据表明NLRP3 炎症小体在动脉粥样硬化进展过程中发挥重要作用[4]。 芪丹通脉片是课题组在总结长期使用益气活血法治疗动脉粥样硬化、缺血性心脏病的临床经验中形成的中药复方,2001 年获得新药证书和药品注册批件(国药准字:Z20090252)。 课题组前期基础证明芪丹通脉片具有抗炎、稳定斑块的作用[5-6],本实验通过研究益气活血配伍复方芪丹通脉片对巨噬细胞泡沫化过程及其进程中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLR pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症小体、下游炎性因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的影响,以深入探究其抗动脉硬化的作用靶点。

1 材料和方法

1.1 细胞株与动物

RAW264.7 小鼠单核巨噬细胞株,购自武汉巴菲尔生物技术服务有限公司;雄性SD 大鼠8 只,6周龄,体质量为(280±20)g,购自空军军医大学动物实验 中心。 适应 性饲 养 1 周 ( 合 格 证 号:11400700180466)。

1.2 药物、试剂与仪器

芪丹通脉片浸膏干粉(黄芪30 g、丹参30 g、当归15 g、红花30 g、桂枝10 g),取红花于 60℃以下烘干,粉碎; 取丹参醇提后再浓缩成浸膏; 取炙黄芪等三味药材和剩余量红花粗粉及丹参药渣用水煎煮两次,合并二次煎液,浓缩成浸膏。 将红花细粉与水提浸膏及醇提浸膏混合均匀,60℃以下烘干,再粉碎成细粉。 其余各组药物浸膏制备与芪丹通脉片制备工艺大体相同。 1 g 芪丹通脉片浸膏干粉相当于生药2.86 g[7]。

酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法试剂盒:白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司, 货号:E-EL-M0037c、E-EL-M0730c;CCK-8 (cell counting kit-8)试剂盒购自东仁化学科技有限公司,货号:CK04;BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天,货号:12658;兔多抗NLRP3 购自武汉三鹰,货号:9771-1-AP;兔多抗半胱氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)购自英国Abcam 公司,货号:ab62698;兔多抗磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)购自杭州贤至生物科技有限公司,货号:AB-P-R001;引物合成购自北京擎科新业生物技术有限公司;Trizol 购自中国Aidlab 生物技术有限公司,货号:15596-018);逆转录试剂盒购自美国GeneCopoeia 公司,货号:QP070。

二氧化碳 CO2细胞培养箱(型号: MCO-20AIC),购自美国Thermo 公司;低速离心机(型号:TD5A)、高速低温离心机(型号:KH20A)、超净工作台(型号:BBS-DDC)、倒置荧光相差显微镜(型号:IX73),均购自日本 Olympus 公司;全功能酶标仪购自Bio Tek 公司,型号:Synergy H1;磁力搅拌器购自江苏省金坛市中大仪器厂,型号:T8-1;水平电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司,型号:JY300;移液器购自德国 Eppendorf 公司,型号:3120000011;实时荧光定量PCR 仪ABI7900 购自美国 ABI 公司,型号:7900Fast。

1.3 细胞培养

小鼠源巨噬细胞RAW264.7,培养在含10%FBS 的 DMEM 培养基中,置于37℃、相对湿度≥95%、含5%CO2的培养箱中培养,每隔2 ~3 天传代1 次。 调整对数生长期细胞数为1×106/L 用于实验,加入6 孔板培养,DMEM 培养基诱导前培养12小时。

1.4 芪丹通脉片含药血清的制备

大鼠每天按体重灌胃一日2 次,每次2 mL,芪丹通脉片浸膏干粉混悬3.24 g/(kg·d), 7 天后分离腹主动脉取血,用离心机离心后,用无菌试管取血清 3 mL,56℃灭活 30 分钟,-20℃ 冰箱中密封冻存。

1.5 分组及泡沫细胞方向诱导

细胞融合达到40% ~50%,从对照组至复方组更换培养液(含非沉默siRNA),复方+ siRNA 组换培养液 (复方 + 含 NLRP3siRNA)。 取 DEPC 水125 μL加入含有 NLRP3siRNA 或非沉默 RNA 冻干粉中混匀,配置终浓度为20 μM。 在 jet PRIME 缓冲液中加入siRNA 溶液或siCon 溶液充分混匀后加入jet PRIME 试剂,室温静置10 分钟混匀,在培养液中加入转染混合液混匀,诱导前24 小时分别加入等量试剂于各组细胞中共同培养。 按照实验要求分别处理各组细胞,对照组:DMEM 高糖培养液(10%FBS);ox-LDL 诱导组:同等浓度培养液+ox-LDL(50 mg/L),于37℃环境下同孵24 小时;益气组:同等浓度培养液+ 黄芪含药血清共培育12 小时后加入ox-LDL(50 mg/L)培育24 小时;活血组:同等浓度培养液+丹参含药血清共培育12 小时后加入 ox-LDL (50 mg/L) 培 育 24 小 时; 复 方 组(QDTM):同上培养液+15%芪丹通脉片含药血清共培育12 小时后加入ox-LDL(50 mg/L)培育24 小时。 复方+ siRNA 组:转染后处理同复方组。 油红染色后使用Image-Pro Plus 软件分析各组细胞泡沫化诱导率(以油红O 着色面积/细胞总面积分析)。

1.6 ELISA 法检测细胞上清液中 IL-1β 及 IL-18 的表达水平

裂解细胞,收集细胞DNA 及蛋白,保存备用。清液保存于-20℃。 采用ELISA 法按照试剂盒(Life Technologies)说明书分别检测外周血中 IL-1β 和IL-18 水平,每组重复5 次。

1.7 实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)分析各组细胞NLRP3、Caspase-1 的表达情况

提取细胞RNA,逆转录成cDNA,RT-PCR 法测定NLRP3、Caspase-1 基因表达。 反应条件:扩增条件:50℃ 2 分钟,95℃ 10 分钟;95℃ 30 秒,60℃ 30秒,40 循环。 以 GAPDH 作为内参。 由计算机自动计算得出CT 值进行分析。 引物序列见表1。

表1 引物序列

1.8 免疫印迹法(western blot,WB)分析各组细胞NLRP3、Caspase-1 的蛋白表达情况

将细胞裂解后匀浆,取上清,由BCA 法检测蛋白浓度,以40 μg 蛋白/每泳道上样,电泳后转至PVDF 膜,分别加入兔多抗 NLRP3(1 ∶1000)、Caspase-1(1 ∶800)及 GADPH(1 ∶1000)一抗,4℃孵育过夜。 洗膜 5 ~6 次,5 分钟/次,HRP 标记二抗,1 ∶50000 稀释,37℃摇床孵育2 小时。 洗膜5 ~6 次,5 分钟/次。 曝光显色后用 BandScan 5.0 分析胶片灰度值。

1.9 统计学方法

数据分析使用SPSS 22.0 软件。 本实验计量资料均符合正态分布且方差齐,以均值±标准差()表示,多组间比较采用单因素方差分析(oneway ANONA),组间两两比较采用LSD检验(独立样本t检验),P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 巨噬细胞泡沫化程度的油红O 染色分析

对照组细胞几乎没有油红O 着色,诱导后的各组细胞均出现不同程度的油红O 着色;ox-LDL 诱导组细胞油红着色面积比值最高,其余四组油红O 着色面积比值与ox-LDL 诱导组比较降低均具有统计学意义,其中复方组及复方+siRNA 组油红着色面积比值最低,与益气组及活血组比较均具有统计学意义。 研究结果提示:益气活血中药能明显减低细胞泡沫化进程,其中益气活血配伍组作用优于益气组、活血组。 如图 1、表 2 示。

图1 各组巨噬细胞泡沫化诱导后油红O 染色结果(×100)

表2 各组细胞泡沫化诱导后油红O 染色结果()

表2 各组细胞泡沫化诱导后油红O 染色结果()

注: 与对照组相比,aP<0.05;与 ox-LDL 诱导组相比,bP<0.05;与益气组相比,cP<0.05 ; 与活血组相比,dP<0.05。

组别 油红O 着色面积/细胞总面积(%)0±0 ox-LDL 诱导组 14.94±1.78a益气组 4.90±0.57b活血组 3.36±0.37b复方组 1.89±0.35bcd复方+siRNA 组 1.37±0.29对照组bcd

2.2 各组细胞IL-1β 及IL-18 的表达水平分析

如表3 所示:对照组中 IL-1β 及 IL-18 含量最低,与对照组比较其它各组的IL-1β 及IL-18 含量均升高,与ox-LDL 诱导组比较益气组、活血组、复方组、复方+siRNA 组 IL-1β 及 IL-18 含量降低具有统计学意义,其中复方组与复方+siRNA 组 IL-1β 及IL-18 含量较益气组、活血组降低具有统计学意义。

表3 各组细胞IL-1β、 IL-18 表达水平比较()

表3 各组细胞IL-1β、 IL-18 表达水平比较()

注: 与对照组相比,aP<0.05;与ox-LDL 诱导组相比,bP<0.05;与益气组相比,cP<0.05; 与活血组相比,dP<0.05。

组别 IL-1β(pg/mL) IL-18(pg/mL)22.69±1.86 106.01±4.13 ox-LDL 诱导组 53.16±2.87a 155.71±8.48a益气组 42.31±1.49b 137.60±6.82b活血组 41.26±1.15b 127.41±4.01b复方组 32.61±2.14bcd 109.80±4.23bcd复方+siRNA 组 30.19±1.39bcd 105.91±3.48对照组bcd

2.3 各组细胞 NLRP3、Caspase-1 的 mRNA 表达水平分析

如表4 所示:对照组的 NLRP3、Caspase-1 含量最低;ox-LDL 诱导组 NLRP3、Caspase-1 含量均最高;药物干预的四组与ox-LDL 诱导组相比两个指标降低均具有统计学意义,其中复方组 NLRP3、Caspase-1 含量较益气组、活血组降低具有统计学意义。

表4 各组细胞NLRP3、 Capase-1 mRNA相对表达水平()

表4 各组细胞NLRP3、 Capase-1 mRNA相对表达水平()

注: 与对照组相比,aP<0.05;与ox-LDL 诱导组相比,bP<0.05;与益气组相比,cP<0.05; 与活血组相比,dP<0.05。

1.13±0.12 1.17±0.09 ox-LDL 诱导组 6.48±0.84a 3.57±0.32a益气组 4.80±0.90b 3.20±0.35b活血组 3.70±0.59b 2.50±0.26b复方组 1.87±0.34bcd 1.71±0.21bcd复方+siRNA 组 1.78±0.31bcd 1.53±0.15 NLRP3 mRNA Capase-1 mRNA对照组组别bcd

2.4 各组细胞NLRP3、Caspase-1 的蛋白表达水平分析

从Western-blot 检测结果来看,ox-LDL 诱导组NLRP3、Caspase-1 含量最高,与 ox-LDL 诱导组比较,其它各组的NLRP3、Caspase-1 含量均明显降低;其中复方组及复方+siRNA 组 NLRP3、Caspase-1 的含量较益气组、活血组降低具有统计学意义。 见图2、表 5。

表5 各组细胞NLRP3、 Capase-1 蛋白相对表达水平比较()

表5 各组细胞NLRP3、 Capase-1 蛋白相对表达水平比较()

注: 与对照组相比,aP<0.05;与 ox-LDL 诱导组相比,bP<0.05;与益气组相比,cP<0.05 ; 与活血组相比,dP<0.05。

0.97±1.19 0.15±0.02 ox-LDL 诱导组 3.40±0.26a 0.45±0.33a益气组 2.42±0.21b 0.32±0.02b活血组 2.43±0.20b 0.29±0.03b复方组 1.61±0.17bcd 0.19±0.01bcd复方+siRNA 组 1.23±0.32bcd 0.16±0.02 NLRP3 Capase-1对照组组别bcd

图2 各组细胞NLRP3、Caspase-1 蛋白的表达

3 讨论

研究预测2030 年,我国心血管疾病患者将增加2100 余万,与心血管相关疾病导致死亡的人数或将增加770 万[8]。 因此,冠心病导致的心脑血管事件已经成为影响国民健康及影响医疗财政支出的重要因素。 从不稳定斑块的初始形成至发展成冠心病再到出现严重并发症及恶性心血管事件这一中间进程其实是需要一定时间的,那么在中医“未病先防,已病传变”思想的指导下,针对动脉粥样硬化的治疗方案及靶点迫在眉睫。 强调在冠心病不稳定斑块形成的早期提早干预不稳定斑块的发生、发展、破裂对治疗冠心病、预防心脑血管事件至关重要。

粥样硬化斑块的形成是冠心病的早期表现,中医“心痛、胸痹”等范畴可涵盖冠心病的概念,认为ACS 发病及进展多为本虚标实,本虚以气虚为主,标实则多为血瘀、痰浊。 其中血瘀病机贯穿冠心病治疗的始终。 近年来众多实验研究表明益气活血中药通过影响脂质代谢、抗炎、保护血管内皮、抑制平滑肌增殖等方面起到稳定斑块的作用[9-11],因此对益气活血药物的研究可能为临床稳定动脉粥样硬化斑块,防治ACS 提供一个重要的方向。

课题组前期研究发现芪丹通脉片具有抗炎、稳定斑块的作用[12]。 本实验结果表明芪丹通脉片能抑制 ox-LDL 诱导后炎性因子 IL-1β 及IL-18 的分泌,可减少巨噬细胞泡沫化。 同时可显著下调NLRP3、Caspase-1 的表达水平,抑制 NLRP3 介导的炎症反应。 既往研究发现芪丹通脉片通过调节TLR4-NF-κB 信号通路发挥干预斑块的作用[13-14],而NLRP3 炎性小体活化需要活化核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)参与[15-16],既然益气活血中药可以同时调节TLR4-NF-κB 信号通路及干预NLRP3 炎症小体及其下游炎性因子,那么它是否通过调节该靶通路影响NLRP3 炎症小体的激活来发挥作用呢? TLR4-NF-κB 信号通路及NLRP3炎症小体在益气活血药抗炎的过程中是否具有协同作用? 有待进一步探索。

综上所述,炎症反应参与动脉粥样硬化斑块易损化进程中,芪丹通脉片能显著下调 NLRP3、Caspase-1 及其下游炎性因子IL-1β 及IL-18 的表达水平,减少泡沫细胞形成,这可能是其稳定斑块的作用机制之一,此外,研究表明益气活血配伍后的疗效明显优于单一治法组,从而丰富了中医经典益气活血配伍的科学内涵。