健脾利湿泄浊方对脾虚湿阻型肥胖大鼠减肥作用的研究

赵子楠 朱依琳 郑立新 陶然 蔡祥焜 张楠 王淳 张建军 田世民 王林元

随着当代生活水平的提高居民膳食结构的改变,肥胖的发病率近年来迅速增加,已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题[1-3]。 肥胖与心血管、内分泌代谢、神经系统、消化系统等多种领域疾病均存在相关性[4-6],其并发症如高血压、血脂紊乱、糖尿病等对人体健康造成严重危害。 肥胖作为亟需解决的健康问题,为社会造成极大经济负担,因此探寻安全有效经济的天然减肥产品具有重要意义。

中医药自古以来对肥胖的病机与诊断治疗具有深入广泛的研究。 相比于西药及外科手术减重,中医药注重辨证论治,个性化诊疗,具有整体调节、多靶点、安全经济的优势[7-9]。 中医将肥胖分为脾虚湿阻、阴虚内热、肝瘀气滞等多种证型,其中脾虚湿阻型肥胖临床较为常见[10]。 据此,本研究以脾虚湿阻型肥胖大鼠为研究对象,将奥利司他和参苓白术散作为对照,探讨中药新产品健脾利湿泄浊方对脾虚湿阻型肥胖的减肥作用,以期为中药类减肥产品的开发与合理应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

雄性健康 SPF 级 SD 大鼠100 只,6 ~7 周,体质量(180±20)g,购自斯贝福(北京)生物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2019-0010,饲养于中国检验检疫科学研究院综合检测中心SPF 级动物实验室[SYXK(京)2018-0007]。 高热量饲料由北京华阜康生物科技股份有限公司提供[许可证号:SCXK(京)2019-0008]。 饲养条件:室温 20 ~22 ℃,相对湿度为60% ~70%,灯照周期为12 小时,7:00 ~19:00 灯照,19:00 ~7:00 黑暗。 试验符合相关动物伦理学要求。

1.2 药物

健脾利湿泄浊方由茯苓、荷叶、山楂、葛根、泽泻、决明子组成,饮片由北京晨益药业有限公司提供,经北京中医药大学中医学院科研实验中心李伟副主任药师鉴定。 奥利司他胶囊(批号:201019,0.12 g/粒)、参苓白术散(批号:20111013,6 g/袋)分别购自重庆华森制药股份有限公司和北京同仁堂制药有限公司。

1.3 试剂与仪器

谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)试剂盒(批号:20102515,购自北京利得曼生化股份有限公司)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)试剂盒(批号:20100405,购自北京利得曼生化股份有限公司)、肌酐(creatinine,CREA)试剂盒(批号:141120019,购自深圳迈瑞医疗电子股份公司)、瘦素(leptin,Lep)试剂盒(批号:20210225,购自北京康佳宏原生物科技有限公司)、 白细胞介素 6(interleukin-6,IL-6)试剂盒(批号:20210225,购自北京康佳宏原生物科技有限公司)、白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)试剂盒(批号:20210229,购自北京康佳宏原生物科技有限公司)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α) 试 剂 盒 ( 批 号:20210311,购自北京康佳宏原生物科技有限公司)、神经肽 Y(neuropeptide Y,NPY) 试剂盒(批号:20210309,购自北京康佳宏原生物科技有限公司)。

日立7600 全自动生化仪(日本日立公司),Multiskan MK3 酶标仪(Thermo Fisher Scientific 公司),GC-2010 型免疫计数器(安徽中科中佳科学仪器有限公司),TGL-16c 型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.4 药物制备

取奥利司他胶囊4 粒(120 mg/粒),去除囊皮,内容物用100 mL 0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成4.8 mg/mL 的灌胃液,按1 mL/100 g 给大鼠灌胃。取参苓白术散3 袋,配制成0.18 g/mL 的灌胃液,按1 mL/100 g 给大鼠灌胃。

取健脾利湿泄浊方提取干膏粉(加水浸泡0.5小时,煎煮2 次,每次1.5 小时,第一次加水12 倍量,第二次加水10 倍量,滤过,合并提取液进行浓缩、干燥、粉碎、过筛得到干膏粉)溶于热水中配制成高、中、低剂量(0.14、0.07、0.035 g/mL)灌胃液。

1.5 造模与给药

大鼠适应性喂养7 天后按体质量随机分成2组,10 只大鼠给予维持饲料作为空白对照组,90 只给予高热量饲料(在维持饲料中添加15% 蔗糖、15%猪油)作为模型对照组。 每周记录摄食量,称重体质量1 次。 喂养2 周后,给予高热量饲料的大鼠按体质量增重排序,淘汰体质量增重较低的1/3肥胖抵抗大鼠,筛选肥胖敏感大鼠。

将筛选出的60 只肥胖敏感大鼠按体质量随机分成6 组,分别为模型对照组、奥利司他组、参苓白术散组和健脾利湿泄浊方低(120.4 mg/kg)、中(240.8 mg/kg)、高(361.2 mg/kg)剂量组,每组10只。 其中健脾利湿泄浊方低剂量相当于茯苓、泽泻饮片剂量各为143.3 mg/kg,荷叶、葛根、决明子饮片剂量各为86.0 mg/kg,山楂饮片剂量为57.3 mg/kg。

给药组给予高热量饲料,空白对照组给予维持饲料。 各给药组大鼠灌胃相应剂量的受试样品,空白对照组和模型对照组大鼠给予等量蒸馏水,连续6 周。 实验第43 天,采用1%戊巴比妥钠(0.5 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,腹主动脉取血,保存血清和血浆;同时固定部分肝组织,液氮冻存肝脏、脾脏、胃和小肠组织。

1.6 检测指标

1.6.1 一般状态观察 记录各组大鼠给药后毛发、精神状态等体征。

1.6.2 大鼠摄食量、体质量、体内脂肪含量及脂/体比的变化 记录各组大鼠每周平均摄食量、体质量及给药后大鼠附睾周围脂肪、肾周脂肪含量的变化,称重并计算脂/体比。 脂/体比=[肾周脂肪(g)+附睾脂肪(g)]/体质量(g)×100%。

1.6.3 大鼠血清ALT、冬氨酸酶AST 及肌酐CREA含量检测 收集大鼠血清,采用IFCC 速率法按照试剂盒方法测定血清ALT、AST 水平;采用免疫比浊法按照试剂盒方法测定CREA 水平,具体操作方法严格按照说明书进行。

1.6.4 大鼠血清 IL-6、IL-10、TNF-α、Lep 和 NPY 含量检测 收集大鼠血清,采用酶联免疫法按照试剂盒方法测定 IL-6、IL-10 和 TNF-α 含量,具体操作方法严格按照说明书进行。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态比较

模型对照组大鼠造模后出现毛发干枯,倦怠少动,粪便形状不规则等情况。 与模型对照组比较,参苓白术散组、奥利司他组和健脾利湿泄浊方各剂量组对上述状况均有一定改善。

2.2 各组大鼠摄食量的变化情况

给药后,模型对照组大鼠与健脾利湿泄浊方低、中、高三个剂量给药组大鼠的摄食量变化不大,最后一周略有降低。 与模型对照组相比,各给药组大鼠摄食量数据无显著性差异。 给药期间各组大鼠均无死亡情况,无腹痛腹泻情况,饮食状态、精神状态良好,表明健脾利湿泄浊方具有良好的安全性。 见表1。

表1 各组脾虚湿阻型肥胖大鼠摄食量变化情况(,n=10,g)

表1 各组脾虚湿阻型肥胖大鼠摄食量变化情况(,n=10,g)

±13.41模型对照组 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63奥利司他组 184.70±20.13 184.70±20.13 184.70±20.13 184.70±20.13 184.70±20.13 184.70±20.13 184.70±20.13参苓白术散组 190.59±19.48 190.59±19.48 190.59±19.48 190.59±19.48 190.59±19.48 190.59±19.48 190.59±19.48低剂量组 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63 183.85±32.63中剂量组 183.85±19.48 183.85±19.48 183.85±19.48 183.85±19.48 183.85±19.48 183.85±19.48 183.85±19.48高剂量组 188.33±13.40 188.33±13.40 188.33±13.40 188.33±13.40 188.33±13.40 188.33±13.40 188.33组别 给药前 第一周 第二周 第三周 第四周 第五周 第六周空白组 204.84±17.77 206.90±13.41 206.90±13.41 206.90±13.41 206.90±13.41 206.90±13.41 206.90±13.40

2.3 各组大鼠干预前后体质量变化比较

给药前各组大鼠体质量之间无显著性差异。第1 周,与空白组比较,模型对照组体质量显著升高(P<0.01),参苓白术散组体质量明显低于模型对照组(P<0.05),其余各组无显著性差异;第2、3周,与模型对照组比较,健脾利湿泄浊方低剂量组和参苓白术散组体质量显著降低(P<0.05);第4周至第6 周,各给药组体质量均显著低于模型对照组(P<0.05,P<0.01)。 见表 2。

表2 各组脾虚湿阻型肥胖大鼠体质量变化情况(,n=10,g)

表2 各组脾虚湿阻型肥胖大鼠体质量变化情况(,n=10,g)

注: 与模型对照组比较,aP<0.05,bP<0.01。

组别 给药前 第一周 第二周 第三周 第四周 第五周 第六周空白组 332.80±35.05 385.21±22.21b 422.03±25.09b 445.79±29.66b 464.61±35.71b 485.99±39.06b 499.57±41.96b模型对照组 365.68±19.31 428.84±28.82 481.51±36.50 524.45±46.88 562.95±53.07 604.21±59.10 645.01±63.32奥利司他组 358.54±15.46 415.28±24.70 463.87±32.34 500.75±39.00 530.76±44.91b 558.72±48.31a 583.71±52.00b参苓白术散组 355.68±14.50 407.27±24.28a 455.48±30.41a 493.37±37.96a 516.33±45.20b 547.76±50.43b 566.49±52.98b低剂量组 357.92±18.16 414.88±27.42 461.78±30.07a 493.37±37.38a 522.62±44.66b 554.37±52.29b 572.31±47.85b中剂量组 356.95±14.03 416.92±23.74 465.83±30.92 503.99±39.54 534.99±47.51a 569.97±53.65a 582.34±51.89b高剂量组 360.01±16.54 412.39±19.20 464.33±23.23 498.96±28.75 527.28±35.23a 557.47±40.59a 582.16±46.05b

2.4 各组大鼠体内脂肪及脂/体比结果比较

模型对照组大鼠附睾周围脂肪、肾周脂肪及相应的脂/体比显著高于空白对照组(P<0.01)。 参苓白术散组与健脾利湿泄浊方低剂量组体内脂肪及脂/体比显著低于模型对照组(P<0.01),健脾利湿泄浊方中剂量组附睾周围脂肪及脂/体比、肾周脂/体比显著降低(P<0.05,P<0.01),健脾利湿泄浊方高剂量组仅肾周脂/体比显著下降(P<0.05);奥利司他组附睾体周围脂肪、附睾体周围脂/体比、肾周脂/体比下降显著(P<0.01)。 见表3。

表3 各组脾虚湿阻型肥胖大鼠附睾肾周脂肪含量及相应脂/体比比较(,n=10)

表3 各组脾虚湿阻型肥胖大鼠附睾肾周脂肪含量及相应脂/体比比较(,n=10)

注: 与模型对照组比较,aP<0.05,bP<0.01。

组别 附睾周围脂肪(g) 附睾周围脂/体比(%) 肾周脂肪(g) 肾周脂/体比(%)空白组 8.46±1.73b 1.67±0.60b 3.62±1.73b 0.65±0.18b模型对照组 21.03±7.86 3.51±0.80 7.65±2.49 1.27±0.24奥利司他组 17.98±2.02b 2.73±0.62b 6.28±2.02 0.97±0.19b参苓白术散组 17.98±2.02b 2.27±0.68b 5.26±2.03b 0.81±0.27b用药低剂量组 14.58±2.28b 2.09±0.57b 5.24±2.28b 0.75±0.29b用药中剂量组 16.41±2.69a 2.59±0.66b 6.00±2.69 0.94±0.34b用药高剂量组 17.30±1.35 3.07±0.64 6.04±1.35 1.04±0.20a

2.5 各组大鼠血清ALT、AST、CREA 含量比较

模型对照组较空白对照组大鼠ALT、AST 以及CREA 指标没有明显变化,各给药组ALT、AST 以及CREA 与模型对照组对比均无显著性差异,提示可能给药后未对大鼠肝肾功能造成损伤。 见表4。

表4 各组脾虚湿阻型肥胖大鼠ALT、AST以及CREA 含量比较(,n=10)

表4 各组脾虚湿阻型肥胖大鼠ALT、AST以及CREA 含量比较(,n=10)

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2.6 各组大鼠血清 IL-6、IL-10 及 TNF-α 含量比较

模型对照组大鼠血清IL-6、TNF-α 含量显著高于空白对照组(P<0.01),IL-10 含量显著低于空白对照组(P<0.01)。 与模型对照组比较,奥利司他组、参苓白术散组以及健脾利湿泄浊方低中高组血清 IL-6、TNF-α 含量均显著降低(P<0.01),IL-10 含量显著上升(P<0.01)。 与奥利司他组、参苓白术散组比较,健脾利湿泄浊方低剂量组IL-6 含量显著降低(P<0.05,P<0.01),健脾利湿泄浊方中、高剂量组 IL-6、TNF-α 含量显著降低(P<0.01),IL-10 含量显著升高(P<0.01)。 见表5。

表5 各组脾虚湿阻型肥胖大鼠血清IL-6、IL-10 及 TNF-α 含量比较(,n=10)

表5 各组脾虚湿阻型肥胖大鼠血清IL-6、IL-10 及 TNF-α 含量比较(,n=10)

注: 与模型对照组相比,a P<0.05,b P<0.01;与奥利司他组相比,cP<0.05,dP<0.01;与参苓白术散组对比,eP<0.05,fP<0.01。

组别 IL-6(pg/mL) IL-10(pg/mL) TNF-α(pg/mL)空白组 52.24±7.61b 70.50±6.70b 60.98±9.44b模型对照组 110.14±19.12 44.12±5.60 75.14±5.20奥利司他组 86.63±5.63b 62.97±7.39b 68.33±5.35a参苓白术散组 88.50±14.95b 60.11±6.57b 65.58±5.18b用药低剂量组 70.59±16.07bde 64.46±6.68b 59.34±6.52b用药中剂量组 61.23±14.22bdf 73.20±5.02bdf 56.06±6.77bdf用药高剂量组 52.03±14.67bdf 77.27±8.37bdf 50.57±7.82bdf

2.7 各组大鼠Lep 和NPY 含量比较

模型对照组大鼠Lep 含量显著高于空白对照组(P<0.01),NPY 含量显著低于空白对照组(P<0.05)。与模型对照组比较,奥利司他组、参苓白术散组以及健脾利湿泄浊方各剂量组血清Lep 含量均显著降低(P<0.01),健脾利湿泄浊方高剂量组NPY 含量显著上升(P<0.01);与奥利司他组比较,健脾利湿泄浊方各剂量组Lep 含量均显著降低(P<0.01),健脾利湿泄浊方高剂量组 NPY 含量显著上升(P<0.01);与参苓白术散组比较,健脾利湿泄浊方中剂量组Lep 含量显著降低(P<0.05),健脾利湿泄浊方高剂量组NPY 含量显著上升(P<0.05)。 见表6。

表6 各组脾虚湿阻型肥胖大鼠血清Lep、血浆NPY 含量比较(,n=10)

表6 各组脾虚湿阻型肥胖大鼠血清Lep、血浆NPY 含量比较(,n=10)

注: 与模型对照组相比,a P<0.05,b P<0.01;与奥利司他组相比,cP<0.05,dP<0.01;与参苓白术散组对比,eP<0.05,fP<0.01。

组别 Lep(ng/mL) NPY(pg/mL)空白组 1.28±0.32b 115.27±24.95a模型对照组 3.89±0.83 90.02±29.96奥利司他组 2.90±1.25b 94.29±26.30参苓白术散组 2.60±0.84b 93.59±20.61用药低剂量组 2.09±0.48bd 107.73±45.86用药中剂量组 1.95±0.68bde 111.82±28.33用药高剂量组 2.10±0.46bd 126.26±35.82bde

3 讨论

本研究健脾利湿泄浊方以茯苓、荷叶、山楂、葛根、泽泻、决明子组方,茯苓为君药,荷叶和山楂为臣药,具有健脾养胃、利湿化浊和消积导滞功效[11-14]。 依据“饮食自倍,肠胃乃伤”,建立高热量饲料诱导的脾虚湿阻型肥胖大鼠模型。 通过观察模型对照组大鼠精神萎靡,倦怠少动,毛发干枯体征状态及摄食量、体质量、体内脂肪含量等各项现代科学指标,表明模型符合“过食油腻厚味、滋腻肥甘,损伤脾胃;气虚沉困怠惰,缺乏体力活动,使痰湿停滞,造成脾湿健运、湿痰内阻”的脾虚湿阻型肥胖证候特点。

ALT 和AST 是临床诊断肝损伤的金指标,能反映肝功能的损伤情况,血清ALT、AST 水平降低可反映肝组织损伤得到改善[15]。 CREA 目前被用作评价肾功能的最常用指标之一,研究表明当肾脏组织病理性受损,肾小球过滤程度降低时,CREA 显著升高[16]。 本实验研究对象为具有减肥功能的中药复方,针对人群为亚健康状态的肥胖人群,在造模时避免造成病理性损害较大的动物模型。 实验结果表明,模型对照组大鼠ALT、AST 及CREA 含量较空白组大鼠无显著性差异,健脾利湿泄浊方低中高剂量组大鼠三项指标较模型对照组大鼠无显著性差异。 结果显示造模及健脾利湿泄浊方均未对大鼠造成肝肾损伤,健脾利湿泄浊方在发挥显著减肥作用的同时兼具安全性。

肥胖是一种由炎症因子诱导的低级别炎症状态,在脂肪生长中有多种脂肪因子在参与炎症免疫反应中发挥重要作用,炎症是造成肥胖发生发展的主要病理机制之一[17-20]。 研究发现肥胖患者体内炎症因子TNF-α 以及IL-6 表达明显增加,能促进脂肪生成及脂肪组织堆积[21];抗炎症因子IL-10 含量在肥胖人群中表达水平下降,导致炎症增加[22]。 同时炎症细胞因子也兼具促血管生成功能[23],研究认为脂肪组织中的血管生成是通过炎症驱动的,内皮细胞功能障碍是肥胖发病的早期事件[24]。 实验结果显示,模型对照组大鼠炎症因子TNF-α 与IL-6 水平较空白对照组显著升高,抗炎症因子IL-10 水平显著降低,表明肥胖大鼠产生明显炎症状态。 给药组较模型对照组炎症因子TNF-α 与IL-6 显著降低,抗炎症因子IL-10 水平显著升高,且健脾利湿泄浊方指标优于阳性药对照组,提示其能改善肥胖状态炎症因子水平,进而发挥调节脂肪作用,其减肥作用可能与调节机体炎症免疫水平相关。

能量摄入与利用失衡是导致患者超重的直接原因,是肥胖发生发展的主要病理机制之一[25]。Lep 是中枢神经系统调节能量代谢的关键调节因子之一,由肥胖基因编码通过激活其受体传递调节脂肪堆积、抑制能量代谢信号[26]。 一方面,Lep 直接作用于脂肪组织[27],抑制脂肪合成,加速脂肪储存能量转化和释放,抑制肥胖发生[28];另一方面,NPY可以通过调控脂肪组织产热,发挥机体能量调节作用[29]。 临床研究表明,肥胖患者Lep 水平较高,但由于能量稳态调节受损,升高的Lep 并不能降低体重,存在Lep 抵抗现象,从而引起食欲调节通路功能障碍和进一步的能量平衡紊乱,而Lep 不敏感已成为导致肥胖的关键原因之一[30]。 本实验模型对照组Lep 显著升高,NPY 明显降低,提示存在能量平衡紊乱,能量代谢异常现象。 给药组较模型对照组Lep 显著降低,NPY 明显升高,其中健脾利湿泄浊方能调节模型大鼠上述指标,且优于阳性药对照组,提示健脾利湿泄浊方可能通过增强瘦素敏感性,调节能量代谢及脂肪堆积,发挥减肥减重作用。

综上,健脾利湿泄浊方具有一定的减肥作用,且指标上整体优于阳性药奥利司他和参苓白术散。通过研究炎症免疫及能量代谢相关指标,探讨其减肥作用,其作用机制可能与调节机体脂肪存储分解合成,调节能量代谢平衡,改善炎症反应等有关,为揭示肥胖机制及指导中药类减肥产品开发应用提供重要的研究价值。