miR-103对鼻咽癌SUNE1细胞生物学行为的影响

王显江，程俊亚，陈小丽

(嘉兴市第一医院 1.重症医学科；2.急诊科，浙江 嘉兴 314000；3.厦门大学 抗癌研究中心，福建 厦门 361005)

鼻咽癌在我国华南、西南地区的发病率极高，其五年生存率为50%～70%，严重影响我国南方地区人民生活质量[1]。鼻咽癌是一种高侵袭性和转移性的头颈部恶性肿瘤，30%～40%的进展期患者会发生远处转移[2]。因此，研究鼻咽癌细胞侵袭和转移的分子机制对于开发新的鼻咽癌治疗方法十分关键。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一组进化保守的内源性非编码小分子RNA，能与mRNA特异性结合在转录后水平负性调控基因的表达。近年来大量研究发现，miRNA在肿瘤发生、发展、侵袭转移和代谢中普遍存在表达失调[3]。Wang等[4]对100例鼻咽癌患者进行miRNA检测后发现miR-103在鼻咽癌患者中上调，且其高表达预示预后不良。miR-103能够通过靶向TIMP-3调控wnt/β-catenin信号通路影响鼻咽癌的发生发展[5]，Dluzen等[6]研究则证实miR-103能够通过PARP-1调节高血压患者的氧化应激。但miR-103是否会通过PARP-1影响鼻咽癌，目前还没有研究报道。本研究旨在分析miR-103对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人鼻咽癌细胞株SUNE1购自中国科学院上海生科院细胞资源中心；RPMI 1640细胞培养基、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶购自美国Gibco公司；miR-103模拟物(miR-103 mimic)，miR-103抑制物(miR-103 inhibitor)和阴性对照(miR-103 negative control, miR-103 NC)由上海吉玛股份有限公司设计并合成；LipofectaminTM 2000购自美国Invitrogen公司；RNA提取试剂盒、CCK-8分析试剂盒和Annexin V-FITC/PI双染试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；单克隆抗体cyclinD1、vimentin、PARP-1和GAPDH购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2 细胞转染与RT-PCR鉴定 取对数生长期SUNE1细胞，每孔1×105个细胞接种于12孔板中，贴壁培养24 h后，按照LipofectaminTM 2000转染试剂盒说明书，分别将miR-103 mimic、miR-103 inhibitor和miR-103 NC转染SUNE1细胞，转染6 h后更换正常培养基。按照RNA提取试剂盒说明书，提取各组细胞RNA，逆转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR法测定miR-103的表达水平。实验设3个复孔，以U6为内参，定量结果以ΔCt表示。

1.3 CCK-8实验 取各组对数生长期细胞，每孔2×104个细胞重新接种于96孔细胞培养板中，每组设置6个复孔。分别培养24 h、48 h、72 h后加入CCK-8试剂，37 ℃温育3 h，酶标仪检测在450 nm处的吸光度， 绘制细胞生长曲线分析细胞增殖情况。

1.4 Transwell实验 取各组对数生长期细胞使用无血清培养基重悬，以每孔1×105个细胞接种于Transwell小室的上室(侵袭实验孔上室需预先加入100 μL基质胶)，下室则加入500 μL含10%胎牛血清的完全培养基，于细胞培养箱孵育24 h。4%多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫染色20 min，显微镜下计数，分析细胞迁移和侵袭情况。

1.5 流式细胞术 收集各组对数生长期细胞，用细胞筛过滤，PBS洗涤2次，计数2×105个细胞，加入0.3 mL Binding buffer重悬细胞， 再加入5 μL FITC- AnnexinV和5 μL PI，避光温育15 min，加入400 μL×Binding buffer，流式细胞仪检测凋亡细胞的百分比。

1.6 Western blot实验 收集各组对数生长期细胞，以RIPA裂解液提取各组总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后于100 ℃下变性5 min；变性蛋白样本等量上样至12%SDS-PAGE进行凝胶电泳分离蛋白，100 mA恒流转膜120 min，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，TBST洗膜后，ECL化学发光，暗室曝光显影，使用Image J 软件计算灰度值。GAPDH为内参。

1.7 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件分析，测量数据以均数±标准差表示，采用非配对t检验，分析各组间差异的显著性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-103转染SUNE1鼻咽癌细胞的miR-103表达水平 RT-PCR检测结果(图1)显示，miR-103 mimic组、miR-103 NC组、miR-103 inhibitor组和SUNE1组的miR-103的表达量分别为(9.737±0.376)、(1.280±0.335)、(0.387±0.074)和(1.000±0.000)，miR-103 mimic组高于miR-103组，miR-103组低于SUNE1组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

注：与对照组(SUNE1)比较，*P<0.05，**P<0.01。下同。

2.2 miR-103对SUNE1细胞增殖的影响 CCK-8检测结果(图2)显示，与SUNE1组相比，miR-103 mimic组在48 h和72 h时的细胞生长速率均明显升高，而miR-103 inhibitor组生长速率明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。

图2 CCK-8检测SUNE1细胞的增殖

2.3 miR-103对SUNE1细胞迁移侵袭的影响 Transwell实验结果(图3)显示，miR-103 mimic组、miR-103 NC组、miR-103 inhibitor组和SUNE1组迁移穿入下室的细胞数分别为(87.67±8.02)个、(50.67±7.09)个、(12.33±3.06)个和(47.67±4.51)个；侵袭入下室细胞数分别为(72.33±8.14)个、(48.33±2.52)个、(11.67±1.53)个和(46.00±4.00)个。与SUNE1组比较，miR-103 mimic组细胞迁移能力和侵袭能力均显著提升，miR-103 inhibitor组细胞迁移能力和侵袭能力均显著减弱，差异均具有统计学意义(P<0.01)。

图3 Transwell分析SUNE1细胞的迁移和侵袭

2.4 miR-103对SUNE1细胞凋亡的影响 流式细胞术检测结果(图4)显示，miR-103 mimic组、miR-103 NC组、miR-103 inhibitor组和SUNE1组的凋亡率分别为(4.05±0.23) %、(4.06±0.15)%、(4.11±0.21)%和(4.18±0.20)%，各组间细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。

图4 流式细胞术检测SUNE1细胞的凋亡

2.5 miR-103对PARP-1和vimentin蛋白表达影响 Western blot实验结果显示，与对照SUNE1组相比，在miR-103 mimic组中vimentin蛋白的表达显著升高，PARP-1蛋白的表达显著降低；在miR-103 inhibitor组中，vimentin和cyclinD1蛋白的表达显著降低，PARP-1蛋白的表达显著升高；差异均有统计学意义(P<0.01)。见图5。

图5 Western blot检测细胞中PARP-1, β-actenin, cyclinD1蛋白的表达

3 讨论

越来越多的研究表明，miRNA参与诸多肿瘤细胞的增殖、分化、转移及凋亡等生物学过程。miR-103是miRNA家族中的一员，最早于2002年在人宫颈癌HeLa细胞系中被发现[7]。miR-103首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下转录生成原始miRNA转录产物(pri-miRNA-103)，在细胞核内被名称为Drosha的RNA内切酶Ⅲ加工得到茎-环结构。随后pre-miRNA-103被exportin-5蛋白运输到细胞质中，再经第二种RNA内切酶Ⅲ -Dicer进一步加工得到成熟双链RNA分子，其中一条成熟链插入RISC，与其靶基因mRNA的3’UTR结合，裂解其靶基因mRNA或抑制蛋白质表达[8]。一种miRNA能调控成百上千种下游基因的表达，不同miRNA之间也有交叉调控的蛋白，这种复杂的网状结构调控着机体细胞的代谢活动[9]。

Fasihi等[10]研究发现，miR-103a在结直肠癌组织中高表达，并能激活Wnt促癌信号通路；Tan等[11]研究发现，miR-103通过靶向PTEN，激活PI3K/Akt信号通路促进肝癌细胞增殖与侵袭能力；Zhao等[12]观察到，血清中高表达miR-103的食管癌患者较正常表达或低表达miR-103的患者生存率明显下降；Zheng等[13]研究发现，miR-103在胃癌中通过KLF4促进增殖与转移；Liang等[14]的研究显示过表达miR-103a能明显抑制胃癌MGC-803细胞的增殖、迁移和侵袭。

本研究在细胞水平上观察到提高miR-103表达能够抑制鼻咽癌SUNE1细胞增殖、迁移和侵袭的能力。Vimentin是一种中间丝蛋白，在多项研究中被证明是细胞运动的重要调节因子，可通过被Akt1磷酸化而增强细胞的迁移和侵袭能力[15]。Western blot实验结果显示，提高miR-103表达鼻咽癌细胞中vimentin蛋白的表达显著升高，提示肿瘤细胞可获得更强的迁移、侵袭能力，此结果与迁移侵袭实验结果相一致。CyclinD1又称G1 /S-特异性周期蛋白-D1，其通过激活G1期特有的周期蛋白依赖性激酶，促进G1周期抑制蛋白的磷酸化，推动细胞周期向S期过渡，其过度表达可致细胞增殖失控而恶性化[16]。Western blot实验结果显示：抑制miR-103表达鼻咽癌细胞中cyclinD1蛋白的表达减弱，但是提高miR-103表达并没有明显增强cyclinD1蛋白的表达，提示miR-103影响鼻咽癌细胞增殖可能另有途径。PAPR是一种聚合酶，PARP-1下游产物表达增加可修复损伤的DNA分子，减少细胞凋亡[17]。miR-103高表达的鼻咽癌细胞中PARP-1表达显著降低，即可能增加细胞凋亡，该作用可能抗衡了cyclinD1介导的细胞增殖。

综上，本研究结果显示miR-103能够在细胞水平影响鼻咽癌细胞的生物学行为，该作用可能涉及到多重分子机制。miR-103有望成为鼻咽癌治疗的新靶点，但其具体分子机制仍需进一步研究。