“紫外-可见分光光度法测定药材的多糖含量”开放性实验的设计*

李 燕，严万莉，曾紫微，肖 竦，何 彬

(贵州医科大学，贵州 贵阳 550025)

近年来，国家高度重视创新型人才的教育和培养[1]。大学生毕业出来是服务于社会，引领社会的发展的，所以国家一直致力于培养创新型人才。但是不得不承认，许多高校的发展落后于社会的发展，在科技技术不断进步的今天，各大企业有了更新的运营模式，更新的仪器设备，而大多数高校仍然在传授多年前就很成熟的各种理论知识，而本来就少的实验课也是“照葫芦画瓢”，只要跟着书本实验步骤做，基本不会出错，从各方面来说，都是不利于社会的发展的[2]。特别是药学专业的学生，不仅要求学生掌握扎实的基础和较广的知识面，还需要具备较强的创新意识，这样才能适应大学毕业以后，成为复合型的高素质的药学人才，从事药学相关的研究开发、教育及质量控制等方面的工作，服务于国家经济社会建设主战场。

传统的教学模式虽然能达到教学的目的，但是“照本宣科”式的教学，容易忽视学生分析问题、解决问题的能力和创新能力的培养[3]。虽然，药学专业课程设置包括了众多科目的基本理论知识以及实验课程，然而，大部分实验课程均为基本的单元操作实验，极少涉及综合性实验或者自主创新实验；大部分实验也与社会实际工作内容相距甚远。现有实验课程与药学专业学生的培养目标还有一定的差距和不足，有必要进行一些新的实验教学改革和尝试。为了提高药学教育的实验教学质量，我们设置了不同类型的开放性实验，让学生自主学习、自主操作的能力得到提高。本文提出针对多种中药材的多糖含量测定设计开放性实验，以培养学生发现、分析、解决问题的能力。

多糖通常指的是10个以上的单糖通过苷键共价连接的一类生物大分子代谢物，在多种中药材中，都含有多糖。最初，人们认为多糖的活性不强，在制备中药提取物的过程中，多糖常常作为杂质被除掉。20世纪70年代以后，许多研究发现多糖广泛参与了细胞生命的生理调节，在许多过程中都发挥了相当重要的作用：抗氧化损伤[4-5]、抗癌抗菌[6]、抗炎[7]等。比如灵芝多糖就是灵芝中最有效的成分之一，其具有多种药理活性，如提高机体免疫力、抗肿瘤、抗辐射等作用[8]；铁皮石斛多糖同样是铁皮石斛的主要有效成分之一，其除了有免疫调节功能、抗肿瘤功能，还具有降血糖、抗氧化、抗衰老的作用[9]。所以，对于不少中药材来说，其多糖含量也是中药材质量控制的标准之一。本文以灵芝多糖为例，以紫外-可见分光光度法来测定灵芝多糖的含量[10]，开展开放性实验。

1 实验设计

1.1 实验目的

(1)培养学生自主学习、自主查阅资料的能力。

(2)培养学生熟悉紫外-可见分光光度计的原理和操作。

(3)培养学生掌握紫外-可见分光光度计法测定不同药材的多糖含量。

1.2 实验原理与方法

(1)原理

紫外-可见吸收光谱是由于分子中的某些基团吸收了紫外-可见辐射光后，发生了电子能级跃迁而产生的吸收光谱。由于各种物质具有各自不同的分子、原子和不同的分子空间结构，其吸收光能量的情况也就不会相同，因此，每种物质就有其特有的、固定的吸收光谱曲线，可根据吸收光谱上的某些特征波长处的吸光度的高低判别或测定该物质的含量[11]。

硫酸蒽酮法是测定多糖含量的较为常用的方法，其原理是：多糖类在浓硫酸的作用下水解为单糖，然后迅速脱水生成糠醛衍生物，其与蒽酮结合成有色化合物，而且在适当波长下和一定浓度范围内其颜色深度(吸光度值)与单糖含量成线性关系，从而可以通过比色测定其多糖含量[12-13]。

(2)方法

本实验采用了灵芝粉末，运用紫外-分光光度法来测定多糖的总含量。以不同浓度无水葡糖为对照品溶液绘制标准曲线，将灵芝供试品溶液所测吸光度代入标准曲线中，计算出灵芝多糖含量。

(3)仪器

UV-2700紫外分光光度计；石英比色皿；移液管；分液漏斗；水浴锅；分析天平；滤纸；干燥箱；洗耳球；漏斗；圆底烧瓶；冷凝管；具塞试管；容量瓶。

1.3 实验内容

(1)供试品的前处理

对于未粉碎的供试品，小于500 g时全部用切片机切片，混匀，用四分法缩分至约100 g；送检样品大于500 g，混匀，随机分取500 g，切片，混匀，用四分法缩分至约100 g。缩分的样品置60 ℃烘箱中干燥4 h，粉碎，全部过三号筛，封装于塑料自封袋中，干燥处保存。

对于粉末供试品，全部过三号筛，不通过部分，粉碎，过三号筛，封装于塑料自封袋中，干燥处保存。

(2)对照品溶液的制备

取无水葡萄糖对照品适量，精密称重，加蒸馏水配成每 1 mL含0.12 mg的溶液。

(3)标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL，分别置于10 mL带塞试管中，然后加蒸馏水至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，摇匀)6 mL，立即摇匀，放置15 min后，立即置冰浴中冷却15 min，取出，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在625 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

(4)供试品溶液的制备

取本品粉末约2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加水 60 mL，静置1 h，加热回流4 h，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤纸置烧瓶中，加水60 mL，加热回流3 h，趁热滤过，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣用水5 mL溶解，边搅拌边缓慢滴加乙醇75 mL，摇匀，在4 ℃放置12 h，离心，弃去上清液，沉淀物用热水溶解并转移至50 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，取溶液适量，离心，精密量取上清液3 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

(5)多糖含量测定

精密量取供试品溶液2 mL，置10 mL具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“迅速精密加入硫酸蒽酮溶液6 mL”起，同法操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得。

①打开紫外-可见分光光度计电源15 min以上；

②用相应的空白溶液分别洗涤两个比色皿各三次，在两个比色皿分别加入空白溶液至比色皿高度的2/3以上；

③将两个盛有空白溶液的比色皿置分光光度计样品和参比光路上；

④在625 nm处进行调零；

⑤取出样品光路中的比色皿，用待测标准溶液润洗比色皿三次，加入待测标准溶液至比色皿高度的2/3以上；

⑥在625 nm处测定吸光度值；

(3)将测试集数据输入到作者身份识别模型中，运用MATLAB进行求解。通过将作者身份识别模型中识别的电子邮件正确数除以模型中总的邮件识别数，得到邮件识别的准确率，以此来衡量研究的准确性。并对程序运行的结果进行分析，得到该方法的识别准确率。

⑦绘制标准曲线(注：相关系数达0.99以上)；

⑧取出样品光路中的比色皿，用待测供试品溶液润洗比色皿三次，加入待测供试品溶液至比色皿高度的2/3以上，在625 nm处测定吸光度值；

⑨从标准曲线上读出供试品溶液中无水葡萄糖(C6H12O6)的量，计算，即得。

(6)多糖含量的计算

取出样品光路中的比色皿弃去标准品溶液，用空白溶液洗涤样品比色皿三次，再用待测供试品溶液洗涤样品比色皿三次，加入待测供试品溶液至比色皿高度的2/3以上，在625 nm处测定吸光度；

记录并根据下式计算灵芝多糖的含量：

灵芝多糖的含量={(m×V1×V3)/ (V2×V4×W)}×10-6×100%

式中：W代表精密称定灵芝细粉的质量，g；m代表测定的供试品溶液的质量，μg；V1为供试品体积，mL；V2为量取供试品体积，mL；V3为稀释后体积，mL；V4为量取稀释后体积，mL。

1.4 思考题

(2)思考选择在625 nm波长处测定吸光度的依据。

(3)如果灵芝供试品所测得的吸光度不在标准曲线范围内，应该采取的措施。

(4)比较紫外-可见分光光度法与HPLC法、以及其他方法的优缺点，以及硫酸蒽酮法和硫酸苯酚法的区别及其优缺点。

(5)如果要测定其他中药材，比如铁皮石斛和人参，尝试合理设计实验。

2 实验的可行性

2.1 实验特点

为了解决传统教学模式单一等问题，采取开放性实验来打破学生“被动”吸收知识的困境，培养学生发挥积极的主观能动性和创新性。

此次的开放性实验是关于中药材的多糖含量测定，多糖含量测定的实验是具有其价值和意义的，多种中药材的多糖含量也是中药材质量控制的标准之一，所以实验内容的选取是符合我们将理论知识运用于实践的。根据糖的理化性质和化学性质，许多多糖含量测定方法被设计出来，在一定范围内是可以达到测定的目的要求的。多糖含量测定方法包括了比色法、滴定法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)、高效毛细管电泳法(HPCE)等方法。其中，比色法使用最为悠久，也是目前最广泛的多糖含量测定方法，特别是蒽酮-硫酸法应用最广泛。当然，针对中草药药材的多糖含量测定方法各有优缺点，具体的多糖含量测定方法的选取需要根据选定药材的多糖及其他化学成分的性质来决定。此外，多糖含量测定方法也会存在一些挑战，比如，不同多糖含量测定方法的标准品的选择、最大检测波长的选择、线性浓度范围、显色后的稳定性、显色时长、药材中各组分之间的干扰等等问题。因此，在多糖含量测定的过程中应排除其他水溶性成分的影响，特别是一些中性糖和酸性糖的相互干扰。总的来说，以灵芝多糖含量测定为例，开展的开放性实验，本实验操作简单，但需学生独立实验，熟知相关理论知识和仪器操作，能让学生从理论知识到实践的锻炼。

2.2 实验可行性

2020年版《中华人民共和国药典》中收载了各种中药材的多糖含量测定方法和相关的标准规定，包括灵芝、人参、枸杞、当归、玉竹、铁皮石斛、昆布、黄精、海藻等多种中药材的多糖含量测定；也有大量的文献报道了多糖含量测定的方法学研究。虽然，各种药材的多糖测定方法不尽相同，但是，总的来说，基本上运用到的都是比色法原理进行测定，即通过糖分子发生氧化还原反应以后，再与显色剂反应生成有色化合物。这就要求利用标准品进行线性范围考查获得标准曲线，在线性范围内的标准曲线区间，获得多糖含量在理论上具有非常强的可行性。对于此次实验所用到的各种仪器，以及各种试剂，均是易得且实验室已具备的，方便学生随时可以操作。在实验过程中，针对已提出的思考题，学生需要查询大量资料方能解决，帮助学生熟悉理论知识，通过学生亲自配置对照品溶液、标准品溶液以及供试品溶液等多个步骤，有利于提高学生的动手操作能力。在实验的过程中，经过讨论，学生能熟练掌握紫外-可见分光光度计的工作原理及具体操作步骤，动手能力与独立思考的能力明显提高，达到了开设开放实验的目的。

3 结 语

开放性实验教学是实验教学改革和发展的内在要求，也是为了适应创新型和应用型人才培养的时代需要，配合学校药学专业本科培养计划的实施，深化实践教学改革，培养学生的创新意识和实践能力，进行日常科研和教学工作的交叉融合，充分挖掘和优化资源配置，提高教学质量。通过该开放性实验的开设，面向药学专业学生，我们为学生提供了一个实验的平台，给学有余力的学生一个自主发展和实践锻炼的机会，强调多学科知识点的交叉融合，强化基础，着眼应用，拓宽学生的知识面，灵活了个性化教学的多样性。在实验过程中，学生可以独立自主完成实验，掌握紫外-可见分光光度计的原理及操作过程，提高学生实验的参与度，以及对实验的积极性，培养学生综合运用知识的能力。经反馈，学生很认可这种开放性实验，收益很大，学生们的动手能力、实验操作技能都得到了普遍的提高，并认为这种模式的教学能让他们学以致用。